Language
Country/Area
No result found
السحر الغامض لمجهر FLIM: كيف نستخدم عمر الفلورسنت للكشف عن أسرار البيئة الدقيقة؟
المبادئ الأساسية لـ FLIM
يعتمد FLIM بشكل أساسي على عمر الجزيئات الفلورية بدلاً من شدة انبعاثها لتوليد الصور. وبعبارة أخرى، فإن تقنية FLIM قادرة على قياس عمر الجزيئات الفلورية، وهو ما يرتبط ارتباطًا وثيقًا بخصائص البيئة المحلية. لذلك، يمكن لـ FLIM القضاء بشكل فعال على الأخطاء الناجمة عن التغييرات في سطوع مصدر الضوء أو شدة الضوء الخلفي أو التبييض الضوئي المحدود.
يعتمد عمر الفلورسنت على خصائص البيئة المحيطة، وبالتالي يمكن أن يوفر مؤشرات حول درجة الحموضة، واللزوجة، والتركيز الكيميائي.
مدة حياة الفلورسنت
عندما يتم إثارة جزيء فلوري بواسطة فوتون، فإنه سوف يعود إلى الحالة الأساسية من خلال مسارات اضمحلال متعددة باحتمالية معينة، على الأقل أحدها هو إصدار الفوتونات من خلال الإشعاع التلقائي. في FLIM، تتبع عملية اضمحلال الفلورسنت الاضمحلال الأسّي الذي يمكن وصفه على النحو التالي:
I(t) = I0 * e^(-t/τ)
حيث، τ يمثل عمر الفلورسنت. النقطة الأساسية هنا هي أن قياس مدى الحياة هذا مستقل عن شدة الفلورسنت الأولية، مما يتيح إجراء قياسات غير مرتبطة بالشدّة في الاستشعار الكيميائي.
أثناء التصوير باستخدام تقنية FLIM، يتم تحديد شدة كل بكسل في الصورة من خلال عمر الفلورسنت، مما يسمح لنا بمراقبة التباينات بين المواد بمعدلات اضمحلال مختلفة حتى عند نفس الطول الموجي، ومراقبة تغييرات مسار التوهين FRET في التصوير.
طريقة الإثارة النبضية
تُستخدم طريقة الإثارة النبضية على نطاق واسع في تقنية FLIM. بعد إثارة الجزيئات الفلورية باستخدام نبضات الليزر فائقة القصر، يظهر الفلورسنت المحدد زمنياً تحللاً أسيًا. ومع ذلك، وبسبب وجود دالة استجابة الجهاز، فإن إشارة الفلورسنت التي يتم قياسها فعليًا لن تكون اضمحلالًا أسيًا خالصًا. ولمعالجة هذه المشكلة، يتم في كثير من الأحيان استخدام تقنية عد الفوتونات الفردية المرتبطة بالوقت (TCSPC)، والتي يمكنها تعويض التغيرات في شدة مصدر الضوء وسعة نبضة الفوتون الفردية.
باستخدام جهاز TCSPC التجاري، يمكن تسجيل منحنيات اضمحلال الفلورسنت بدقة زمنية تصل إلى 405 fs.
طريقة تعديل الطور
تقنية أخرى هي تعديل الطور. تعتمد هذه الطريقة على مصدر ليزر عالي التردد، ويرتبط التغير الطوري لإشارة الفلورسنت الخاصة به بشكل مباشر بمدة حياة الجزيئات الفلورية، مما يتيح سرعة تصوير أكبر في أبحاث الخلايا الحية.
طرق التحليل
يجب تحليل البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة FLIM باستخدام الخوارزميات المناسبة لاستخراج منحنى الاضمحلال النقي وتقدير العمر الافتراضي. تتضمن التقنيات المستخدمة بشكل شائع طريقة المربعات الصغرى والتكرار التكراري. تعد كيفية مطابقة القياس الفعلي مع النموذج المتوقع بشكل فعال أحد التحديات في معالجة بيانات FLIM.
الهدف الرئيسي لهذه التقنية هو استخراج منحنى الاضمحلال النقي عن طريق تقليل المجموع المرجح للمخلفات.
النظرة المستقبلية
يتم استخدام تقنية FLIM بشكل متزايد مع ظهور أدوات التصوير الجديدة، وخاصة في المراقبة في الوقت الحقيقي للتغيرات في داخل الخلايا الحية وبيئتها المحيطة. وتستمر رغبة المجتمع العلمي في الحصول على فهم أعمق للتغيرات الكيميائية داخل الخلايا في دفع تقدم هذه التكنولوجيا.مع تطور تكنولوجيا FLIM، سيتم استكشاف العديد من الألغاز التي لم يتم حلها بعد. كيف ستكشف الأبحاث المستقبلية المزيد من أسرار البيئة المحيطة؟
