Language
Country/Area
No result found
أسرار تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي: كيفية الكشف عن التعبير الجيني من خلال الحمض النووي الريبوزي؟
تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) هو تقنية معملية تجمع بين نسخ الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي (في هذا السياق يسمى الحمض النووي التكميلي أو cDNA) وتضخيم هدف الحمض النووي المحدد. تستخدم هذه العملية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي التفاعل (PCR). تستخدم هذه التقنية بشكل أساسي لقياس كمية الحمض النووي الريبوزي المحدد من خلال مراقبة فلورسنت تفاعل التضخيم، وهو ما يسمى بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي أو تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). في الأدبيات العلمية، يستخدم بعض المؤلفين أحيانًا مصطلح RT-PCR بشكل مربك للإشارة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. في هذه المقالة، نشير إلى RT-PCR على وجه التحديد باسم تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي.
بسبب بساطتها وخصوصيتها العالية وحساسيتها، تم استخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في مجموعة واسعة من التجارب، بدءًا من تحديد كمية خلايا الخميرة في النبيذ وحتى اكتشاف مسببات الأمراض المعدية.
مبادئ وتطبيقات تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي
مبدأ تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي هو تحويل قالب الحمض النووي الريبي أولاً إلى cDNA، والذي يتم تضخيمه بعد ذلك بشكل كبير باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. يسمح لنا هذا التغيير الثوري في العملية باكتشاف نسخ من جميع الجينات تقريبًا وتضخيم العينات، مما يلغي الكميات الكبيرة من المواد الأولية المطلوبة عند استخدام النقل الشمالي.
أصبحت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) واحدة من أهم التقنيات المستخدمة في تحليل التعبير الجيني وتشخيص مسببات الأمراض المعدية. على سبيل المثال، يدرس العلماء كيفية استخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) لاختبار السرطان لتحسين التشخيص ومراقبة الاستجابة للعلاج.
على سبيل المثال، تنتج الخلايا السرطانية المنتشرة نسخًا فريدة من mRNA اعتمادًا على نوع السرطان، ويمكن لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي تحليل مستويات التعبير عن هذه النسخ.
التطور التقني لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي
منذ التقديم الأول لتقنية النقل الشمالي في عام 1977، وعلى الرغم من عيوب هذه التقنية في تحديد كمية الحمض النووي الريبي، مثل استهلاكها للوقت وتطلبها لكميات كبيرة من الحمض النووي الريبي، فقد أصبحت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي طريقة شائعة للكشف عن الحمض النووي الريبي وتحديد كميته منذ اختراع PCR بواسطة كاري موليس في عام 1983. طريقة الاختيار للقياس الكمي. لا تتطلب هذه العملية أي معالجة لاحقة فحسب، بل يمكنها أيضًا قياس وفرة الحمض النووي الريبي أكثر من 107 مرات، مما يوفر بيانات عالية الجودة والكمية.حاليًا، طورت تقنية RT-PCR أوضاع تشغيل مختلفة: توقف واحد وخطوتين. تتطلب تقنية RT-PCR المكونة من خطوتين إجراء النسخ العكسي وتضخيم PCR في أنابيب اختبار مختلفة، بينما يمكن إكمال تقنية RT-PCR المكونة من خطوة واحدة في أنبوب اختبار واحد. على الرغم من أن طريقة التوقف الواحد أكثر ملاءمة للكشف السريع، إلا أنها عرضة لتدهور العينة عند إجراء اختبارات متكررة.
التحديات والاتجاهات المستقبلية لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي
على الرغم من أن تقنية RT-PCR تتمتع بالعديد من المزايا، إلا أنها لا تزال تواجه بعض التحديات. على سبيل المثال، أثناء دورات متعددة من تفاعل البوليميراز المتسلسل، يؤدي النمو الأسّي للحمض النووي التكميلي (cDNA) بعد النسخ العكسي إلى إنتاج كمية غير دقيقة لنقطة النهاية، بينما يتغلب تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي على هذه المشكلة بسبب إضافة تقنية مراقبة الفلورسنت. علاوة على ذلك، فإن الحساسية العالية تعني أن حتى كميات ضئيلة من تلوث الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى تحريف النتائج. ولذلك، فمن الأهمية بمكان التخطيط والتصميم لمصادر التباين في التكنولوجيا.
مع التطور المستمر للتكنولوجيا، تتمتع تقنية RT-PCR بإمكانيات تطبيق واسعة في التشخيص الجيني واكتشاف السرطان والفحص المبكر للأمراض. ومن المتوقع أنه في الأبحاث العلمية المستقبلية، ستلعب هذه التكنولوجيا دوراً أكثر أهمية في فهم التغيرات في التعبير الجيني والآليات التي تكمن وراءها.على سبيل المثال، يمكن أن تساعد إضافة كمية معروفة من الحمض النووي الريبي كعينة مرجعية الباحثين على إجراء الضوابط والتحليلات الكمية.
مع الدراسة المتعمقة لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي، كيف سيساهم تطبيق هذه التقنية في علم الأحياء الجيني في تغيير فهمنا للعمليات الحيوية بشكل أكبر؟
