Quantitative methods for deconvolution of true topographical properties of object on the basis of measured AFM-images: Part 2. Broadening effect
aa r X i v : . [ c ond - m a t . m e s - h a ll ] J u l Количественные методики восстановленияистинных топографических свойствобъектов по измереннымАСМ-изображениям:Часть 2. Эффект уширения АСМ-профиля
М. О. Галлямов, И. В. Яминский
Физический факультет Московского государственногоуниверситета им. М. В. Ломоносова, Москва
Аннотация
Разработана методика количественного описания эффекта уши-рения в АСМ, позволяющая восстановить реальные геометриче-ские параметры объекта по двум измеренным параметрам АСМ-профиля (высота и ширина на полувысоте). Применение методикипозволило получить информацию о количественном молекулярномсоставе комплекса ДНК-ПАВ.
Эффект уширения проявляется в том, что микрообъекты, визуализо-ванные АСМ, имеют завышенные латеральные размеры. Например, приАСМ исследованиях молекул нуклеиновых кислот [1] этот эффект об-легчает идентификацию молекул: “уширенные” молекулы легче обнару-жить на кадре значительной площади, что облегчает набор статистики.В силу этого, при исследовании нуклеиновых кислот, эффект уширенияпозволяет обходится без дополнительного контрастирования макромоле-кул (уранилацетатом и пр.).Эффект уширения связан с тем, что зондирующее острие микроскопаимеет конечный радиус кривизны кончика. Эту аппаратную погрешностьтрудно преодолеть, поскольку уменьшение радиуса кривизны кончиказонда (использование более острых зондов) приводит к увеличению дав-ления в области контакта (при том же значении величины контактных Ширина профиля молекулы ДНК завышается в 5–10 раз ) существенно завышены при условии, что радиус кривизны объекта меньше радиуса кривизны кончика зонда (ошибка тем выше, чем боль-ше разница соответствующих радиусов). Это обстоятельство осложняетприменимость рассматриваемой методики при исследованиях биообъек-тов (макромолекул, их комплексов и пр.) в силу малости размеров по-следних в сравнении с радиусом кривизны кончика зонда АСМ.В работе [4] предложена методика восстановления объема исследуе-мых частиц (по АСМ-профилю), не включающая стадию предваритель-ного тестирования зонда: как геометрия зонда, так и геометрия объектовисследования может быть восстановлена путем анализа одного и того жеАСМ-изображения. Однако данная методика включает априорное пред-положение о сферической форме исследуемых объектов. Но, в силу име-ющихся представлений о существенной роли контактных деформаций в исследованиях АСМ представляется, что данное предположение врядли оправданно при решении задачи восстановления геометрии биообъек-тов , характеризующихся, как известно, невысокими значениями модуля этот параметр используется при определении объема исследуемого объекта b a dh ÇîíäÎáðàçåö Ïîäëîæêà
Рис. 1: Геометрия контакта зонда и образца (к объяснению эффекта уши-рения).упругости. Более общей является модель, позволяющая учесть эффектуширения при контакте иглы с деформированной частицей, имеющей эл-липсоидальное сечение. Но, насколько нам известно, в литературе отсут-ствуют работы, посвященные применению данной модели для анализаэкспериментальных АСМ-изображений, что, по-видимому, обусловленоалгебраическими сложностями, возникающими при нахождении анали-тического решения этой задачи.
Постановка и решение задачи о восстановлении реальной ши-рины объектов по измеренному АСМ-профилю
Мы применили для учета эффекта уширения геометрическую модель(рис. 1), учитывающую взаимодействие объекта только с кончиком зонда(предполагается, что нет контакта со стенками пирамиды). Это оправ-дано в том случае, когда высота исследуемых структур над подложкойне превышает радиуса кривизны кончика иглы.Кончик зонда аппроксимировали либо полусферой радиуса R , либопараболоидом вращения (сечение иглы — парабола: y = kx , где k —коэффициент аппроксимации). При этом было показано, что результатыприменения двух методик, фактически, тождественны. Количественноерасхождение в ответах не превышает 3–9%. Стоит отметить, что аппрок-симация иглы с помощью полусферы более наглядна и более широко ис-пользуется в литературе. Мы ниже приводим алгоритмы использованияобоих подходов.Исследуемая частица описывалась моделью сплюснутого эллипсоида.Т.е. мы исходим из априорных представлений о контактной деформацииобразца под действием зонда. В сечении объекта исследования — эллипс3 полуосями a и b . Ставилась задача по заданным значениям b ( b = h/ ), R (или k для параболической аппроксимации) и d (где d — измереннаяширина профиля АСМ-изображения частицы на ее полувысоте) найтизначение a .Запишем систему уравнений для эллипса (сечение профиля исследу-емой частицы) и окружности (сечение профиля иглы): y ell = b q − x /a y cir = R − q R − ( x − d/ В модели параболической иглы второе уравнение системы примет вид: y par = k ( x − d/ .Для решения задачи ставились условия для точки контакта с коорди-натами ( x , y ): равенство касательных к эллипсу и к окружности (пара-болы) и удовлетворение координат точки контакта уравнениям эллипсаи окружности (параболы): ( b q − x /a = R − q R − ( x − d/ dy ell /dx | x ,y = dy cir /dx | x ,y (1)Для модели параболической иглы в системе (1) вместо уравнения окруж-ности используется уравнение параболы. Данная система аналитическисводилась к одному уравнению с одним неизвестным ( x ) , для которо-го был создан алгоритм численного решения . Ниже мы приводим этиуравнения для случая сферической иглы: (cid:20) b − (cid:16) R − q R − ( x − d ) (cid:17) (cid:21) q R − ( x − d ) ++ x ( x − d ) (cid:16) R − q R − ( x − d ) (cid:17) = 0 (2)и для нахождения a по численно определенному x : a = x r − (cid:16) R − q R − ( x − d ) (cid:17) /b (3)Аналогично, для случая параболической иглы имеем уравнение относи-тельно x для построения численного решения: k ( x − d ) ( x + d ) + b = 0 (4) для x уравнение проще далее, по найденному x определялось a a : a = s x ( x + d )2 (5)Аналитически было показано, что полученное уравнение (2) для сфери-ческой иглы не имеет единственного решения (на соответствующем про-межутке) только в том случае, когда выполняется система неравенств: ( R > d/ b > R − q R − d / (6)Аналогично, уравнение для параболической иглы (4) не имеет единствен-ного решения (на интересующем нас интервале) в случае, когда выпол-няется неравенство: b > kd (7)Смысл данных ограничения очевиден: если АСМ-профиль достаточно“острый”, то и игла, с помощью которой он был прописан, также должнабыть “острой” настолько, насколько это определяется соотношениями (6)или (7).Уравнения (2–5) использовались нами для построения численного ре-шения. Казалось бы, поскольку все равно задача решалась численно,то для реализации численного решения можно было исходить непосред-ственно из системы (1), сведя ее, например, к системе нелинейных урав-нений. Однако оказывается, что специфика системы не позволяет в этомслучае построить достаточно простого численного решения, посколькусколь угодно малые отклонения от точного решения приводят к отри-цательным значениям в подкоренных выражениях, входящих в решае-мую систему. В силу этого предложенный метод является, несмотря нанеобходимость предварительных аналитических выкладок, достаточнопростым, кроме того, он имеет важное преимущество: проверка выпол-нения условий (6) и (7) позволяет заранее определить случаи отсутствиярешений.Эта проверка позволяет извлечь дополнительную и весьма важнуюинформацию о свойствах зондирующего острия: определить верхнююграницу для значений радиуса кривизны кончика R (соответственно,нижнюю для коэффициента параболы k ).Определение точного значения радиуса R (или k ) для конкретногозонда требует его тестирования непосредственно перед использовани-ем (с помощью тест-объектов, например вирусных частиц [5]). Однакои в этом случае существует вероятность того, что в процессе сканиро-вания форма иглы претерпит изменения в результате взаимодействия с5ис. 2: Зависимость числа случаев отсутствия решения от радиуса ап-проксимации иглы, проверка выполнимости условия (6).объектом. В этой связи чрезвычайно полезным является получение ин-формации о форме зонда непосредственно из АСМ-изображений объектаисследования.Путем набора статистики параметров высоты и ширины профиляАСМ-изображений объектов исследования и последующего анализа вы-полнимости соотношений (6, 7) для набранной статистики можно опре-делить предельное значение R (или k ) выше (или ниже) которого ростчисла случаев отсутствия решения. Это и будет верхнее граничное зна-чения для оцениваемого радиуса кривизны иглы, см. рис. 2. Нижняя гра-ница для радиуса кривизны зонда определяется контактными деформа-циями. К вопросу о применимости разработанной методики
Следует подчеркнуть, что разработанная методика не учитывает воз-можного дополнительного вклада в уширение, связанного с частичнымувлечением образца зондом при сканировании. Эффект увлечения обу-словлен латеральными силами взаимодействия зонда и образца, которыехарактеризуются достаточно большой интенсивностью при проведенииисследований в контактном режиме на воздухе, даже при минимизациинормальных сил. По нашим оценкам данный эффект, в основном, можетпроявляться при исследовании объектов, имеющих небольшую величину6лощади сечения (например, одиночных молекул ДНК), и приводить к1,5–2,5-кратному завышению значения ширины объекта d и, как след-ствие, восстанавливаемого значения a .Степень увлечения образца зондом можно снизить при уменьшенииинтенсивности латерального силового воздействия зонда. Это достигает-ся при применении режима прерывистого контакта. Максимальный эф-фект уменьшения латеральных сил достигается при измерениях в жид-ких средах. Применение разработанного алгоритма для восстанов-лении морфологии комплексов ДНК-ПАВ
Мы применили разработанную методику для восстановления геометриикомплексов ДНК с поверхностно-активными веществами (ПАВ), пере-шедших через границу раздела фаз вода/хлороформ, (подробнее резуль-таты изложены в [6]). Для каждой тороидальной частицы измерялисьзначения диаметра тора, ширины профиля на полувысоте и высоты надподложкой, средние значения этих параметров составили: D ∼ нм, d ∼ нм и h ∼ нм. Два последних значения использовались при вос-становлении истинной ширины профиля частицы a , по изложенной вы-ше методике.На рис. 2 представлен график зависимости числа случаев отсутствиярешения от радиуса аппроксимирующего зонда, полученный путем те-стирования выполнения условий (6) или (7). На основании рисунка мож-но сделать вывод, что верхняя граница значения R , характеризующегозонд, используемый при визуализации комплексов, составляет 12 нм (со-ответствует k = 5 , × − нм − ) — выше этого значения наблюдаетсялинейный рост числа случаев отсутствия решения.Мы подсчитали количество молекул ДНК, приходящихся на каждуютороидальную структуру, используя два различных значения R — 6 нм и12 нм (соответствует k — , × − нм − и , × − нм − ). Среднее зна-чение параметра a (найденное численно) для этих случаев составляет 11и 10 нм соответственно (относительное отклонение ε = 0 , ). Результатыприменения параболической модели иглы дают, как правило, значениядля a на 3–9% выше. В рассматриваемом случае соответствующие чис-ленные решения составляют 12 и 11 нм. Таким образом, мы показали,что формой комплекса ДНК-ПАВ является сплюснутый тор. Восстанов-ление геометрии комплекса позволяет провести количественный анализего молекулярного состава, см. рис. 3. Благодарность . Авторы выражают благодарность О. А. Пышкиной и7ис. 3: Гистограммы распределения числа молекул ДНК, входящих всостав комплексов с ПАВ. 8. С. Андреевой (Химический факультет МГУ) за помощь при приготов-лении образцов комплексов ДНК-ПАВ. Работа была поддержана РФФИ,проект №97-03-32778a.
Список литературы [1] С. Bustamante, J. Vesenka, С. L. Tang, W. Rees, M. Guthold, R. Keller// Biochemistry. 1992. V. 31. P. 22[2] H. G. Hansma, J. Vesenka, C. Siegerist, G. Kelderman, H. Morrett,P. L. Sinsheimer, V. Elings, C. Bustamante, and P. K. Hansma //Science. 1992. V. 256. Р. 1180[3] А. А. Бухараев, Д. В. Овчинников, А. А. Бухараева // Заводская ла-боратория.1997. №5. С. 10[4] V. J. Garcia, L. Martinez, J. M. Briceno-Valero, and C. H. Schilling //Probe Microscopy. 1998. V. 1. No 2. Р. 117[5] Yu. F. Drygin, O. A. Bordunova, M. О. Gallyamov, I. V. Yaminsky //FEBS letters. 1998. V. 425. P. 217[6] А. С. Андреева, M. О. Галлямов, О. А. Пышкина, В. Г. Сергеев,И. В. Яминский, // Журнал физической химии. 1999. Т. 73. No.11.С. 2062
Quantitative methods for deconvolution of truetopographical properties of ob ject on the basisof measured AFM-images:Part 2. Broadening effect