T4 DNA condensation in water-alcohol media
M. O. Gallyamov, O. A. Pyshkina, V. G. Sergeyev, I. V. Yaminsky
aa r X i v : . [ c ond - m a t . s o f t ] J u l Конденсация ДНК Т4 в водно-спиртовыхсредах
М. О. Галлямов, О. А. Пышкина, В. Г. Сергеев, И. В. Яминский
Физический и Химический факультеты Московскогогосударственного университета им. М. В. Ломоносова,Москва
Аннотация
Процесс компактизации высокомолекулярной ДНК Т4 иссле-дован в водно-спиртовой среде методом АСМ. Получены АСМ-изображения компактных глобул, образованных молекулами ДНКв водно-спиртовых средах при 80% концентрации спирта; обна-ружено, что при 40–50% концентрациях спирта молекулы ДНКформируют частично компактизованные образования, в которыхотдельные витки макромолекулы закручиваются в тороидальныеструктуры. С привлечением методики восстановления истинныхгеометрических параметров объекта по АСМ-профилю, показано,что в состав глобулы входит одна молекула ДНК. По результа-там исследований предложена модель упаковки ДНК в процессекомпактизации.
Ранее нами было показано [1], что гигантская ДНК Т4 в водно-спир-товой смеси при концентрации спирта более 50% (для изопропанола)претерпевает конформационный переход клубок → глобула. При умень-шении концентрации спирта до 40% наблюдалось частичное разворачи-вание глобул. Однако, в силу ограничения разрешающей способностииспользуемого метода флуоресцентной микроскопии (классический пре-дел λ/ ), оказалось трудным определить микроструктуру полученныхобъектов.Метод сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) может успешноприменяться для исследования конформации и микроструктуры моле-кул ДНК [2,3]. Однако, традиционная схема приготовления образцовдля зондовой микроскопии на воздухе включает процедуру высушивания1апли препарата на поверхности твердой подложки. Процесс высушива-ния является неравновесным и сопровождается трудноконтролируемымиизменениями локальных значений концентрации препарата, что можетпривести к сложностям при интерпретации результатов. Исключить про-цедуру высушивания в схеме СЗМ-эксперимента можно при проведенииисследований в жидкости (с использованием жидкостной ячейки). Экспериментальная часть
В качестве объектов исследования использовали ДНК бактериофага Т4(Nippone Gen). При проведении экспериментов использовали бидистил-лированную деионизованную воду. Водно-спиртовые среды готовили сиспользованием изопропанола (химически чистого).Исследования конденсации молекул ДНК проводили методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) непосредственно в водно-спиртовой смеси ,с использованием подложек слюды. Свежий скол слюды и зонд АСМпомещали в жидкостную ячейку, которую последовательно заполнялииспользуемыми растворами. Препарат, содержащий молекулы ДНК Т4в водно-спиртовой смеси при 80% концентрации спирта, получали сме-шивая один объем раствора ДНК в 0,5 ТВЕ-буфере с четырьмя объема-ми изопропанола. Препарат молекул ДНК в 40% изопропаноле получалисмешивая два объема раствора ДНК в буфере с тремя объемами изопро-панола. В обоих случаях конечная концентрация ДНК в смеси состав-ляла × − моль. Иммобилизация исследуемых структур на подложкеосуществлялась лишь за счет процессов адсорбции из раствора.Эксперименты проводили в жидкостной ячейке АСМ Nanoscope-III(Digital Instruments, USA) в режиме прерывистого контакта с исполь-зованием заостренных кантилеверов из нитрида кремния (Nanoprobe)жесткостью 0,32 Н/м. Результаты и их обсуждение
Препарат, содержащий молекулы ДНК Т4, в водно-спиртовой смеси при80% концентрации изопропанола, вводили в жидкостную ячейку, запол-ненную предварительно водно-спитровой смесью с той же концентрациейспирта. При этих условиях макромолекулы ДНК осаждались на поверх-ность слюды в виде компактных глобул (рис. 1а и 2а).Применение разработанной нами методики восстановления реальныхразмеров исследуемых объектов (учет эффекта уширения ) [4] позволяет2ис. 1: a) — АСМ-изображение компактных глобул, сформированныхмолекулами ДНК в 80% изопропаноле, б) — тот же участок поверхностипосле понижения концентрации спирта в жидкостной ячейке АСМ до40–50%.определить объем и геометрию глобулярных структур по трем извест-ным параметрам: высоте АСМ-изображения над подложкой, ширине наполувысоте АСМ-профиля (для эллипсоида следует использовать двазначения ширины, соответствующие напралениям главных осей) и ра-диусу кривизны иглы. Мы провели расчеты для двух значений радиу-са кривизны иглы: 5 и 10 нм (по нашим оценкам с применением тест-объектов радиус используемой иглы лежит в указанном интервале), см.табл. 1.Значения параметров глобулы, определенные с использованием двухграничных значений для радиуса кривизны иглы, фактически, идентич-ны (с учетом значительной величины стандартного отклонения, что обу-словлено статистическим разбросом анализируемых параметров для раз-личных глобул). Восстановленные значения параметров полуосей a и b позволяют сделать вывод, что геометрической формой глобулы являетсясплюснутый и слегка вытянутый эллипсоид.Из анализа таблицы следует, что объем глобулы составляет величину (2 , ± , × нм , что превышает объем молекулы ДНК Т4: , × нм ( V DNA = πr L , r = 1 нм, L = 55 × нм). Т.о. образом, можнопредположить, что каждая глобула образованна одной молекулой ДНК,находящейся в достаточно плотноупакованном состоянии.3ис. 2: a) — АСМ-изображение компактных глобул, сформированныхмолекулами ДНК в 80% изопропаноле, б) — тот же участок поверхно-сти, после понижения концентрации спирта в жидкостной ячейке АСМдо 40–50%, врезка — одна из глобул исследована с большим разрешени-ем, что позволяет визуализовать центральную полость, проявившуюся врезультате процесса декомпактизации R , нм a , нм b , нм c , нм V , × нм ±
12 55 ±
17 23 ± , ± ,
710 37 ±
12 52 ±
17 23 ± , ± , Таблица 1: Геометрические параметры глобул, образованных молекула-ми ДНК Т4 в результате компактизации спиртом. Расчеты проводилисьпо разработанной нами методике учета эффекта уширения [4] для двухзначений радиуса кривизны иглы R : 5 и 10 нм, приведенные погреш-ности являются стандартными отклонениями средних арифметических,рассчитанных путем статистического анализа АСМ-изображений глобул.Обозначения таблицы: a , b и c — параметры эллипсоида, описывающе-го геометрию глобулы; a и b восстановлены по методике учета АСМ-уширения, c — половина высоты АСМ-изображения глобулы; V — объемэллипсоида, определенный по формуле: V globule = 4 / πabc ; для сравнения:объем молекулы ДНК Т4 V DNA ∼ , × нм Благодарность . Работа выполнена при финансовой поддержке Феде-ральной программы «Университеты России — фундаментальные иссле-дования» (проект №5060) и РФФИ (проект №97-03-32778а).
Список литературы [1] V. G. Sergeyev, S. V. Mikhailenko, O. A. Pyshkina, I. V. Yaminsky,K. Yoshikawa // J. American Chemical Society. 1999. V. 121. P. 1780[2] V. G. Sergeyev, O. A. Pyshkina, M. O. Gallyamov, I. V. Yaminsky,A. B. Zezin, V. A. Kabanov // Progr. Colloid. Polym. Sci. 1997. V. 106.P. 198 73] М. О. Галлямов, О. А. Пышкина, В. Г. Сергеев, И. В. Яминский // По-верхность. 1998. №2. C. 79.[4] А. С. Андреева, М. О. Галлямов, О. А. Пышкина, В. Г. Сергеев,И. В. Яминский // Журнал физической химии. 1999. Т. 73. №11.С. 2062.
T4 DNA condensation in water-alcohol media