Language
Country/Area
No result found
Von der Zelle ins Labor: Wie extrahiert und isoliert man Proteine effizient?
Bei der Proteinextraktion handelt es sich um eine Reihe von Prozessen, die darauf abzielen, ein oder mehrere Proteine aus einer komplexen Mischung von Zellen, Geweben oder ganzen Organismen zu isolieren. Dieser Prozess ist von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung der Funktion, Struktur und Wechselwirkungen von Proteinen. Durch die Proteinextraktion kann nicht nur das Zielprotein von anderen Proteinen getrennt werden, sondern auch die Nicht-Protein-Fraktion. Um ein bestimmtes Protein effektiv untersuchen zu können, muss es von allen Bestandteilen der Zelle getrennt werden, damit Verunreinigungen die Untersuchung der Struktur und Funktion des Proteins nicht beeinträchtigen.
Das reine Ergebnis der Extraktion wird als Proteinisolat bezeichnet.
Beim Proteinextraktionsprozess ist die schnelle und effiziente Isolierung des Zielproteins oft der mühsamste Teil. Bei den Trennungsschritten werden typischerweise Unterschiede in der Proteingröße, den physikochemischen Eigenschaften, der Bindungsaffinität und der biologischen Aktivität ausgenutzt. Da die Nachfrage nach kostengünstigeren und effizienteren Methoden zur Proteinreinigung weiter steigt, ist ein tiefes Verständnis der verschiedenen Proteinreinigungstechnologien und ihrer Optimierung unerlässlich, um die Produktionskosten zu senken und gleichzeitig hohe Qualitätsstandards einzuhalten.
Zweck
Die Produktionskosten für Proteine sind immer noch sehr hoch, was die Entwicklung kostengünstiger und schneller Methoden zur Proteinreinigung umso dringlicher macht. Je nach Zweck kann die Proteinreinigung in zwei Kategorien unterteilt werden: präparativ und analytisch. Der Zweck der präparativen Produktion besteht darin, relativ große Mengen gereinigten Proteins für die spätere Verwendung herzustellen, beispielsweise bei der Herstellung kommerzieller Produkte wie Enzyme (z. B. Laktase), Nahrungsproteine (z. B. Sojaproteinisolat) und bestimmte biopharmazeutische Produkte ( zB Insulin). Durch die analytische Reinigung werden relativ kleine Proteinmengen für Forschungs- und Analysezwecke gewonnen, einschließlich Identifizierung, Quantifizierung und Untersuchung der Proteinstruktur, posttranslationalen Modifikationen und Funktion.
Bei einem hohen Reinigungsgrad, aber einer geringen Ausbeute bleibt kaum genug Protein für die Experimente übrig, während bei einer hohen Ausbeute, aber einem geringen Reinigungsgrad viele Verunreinigungen zurückbleiben, die die Genauigkeit der Studie beeinträchtigen. Daher kommt der Auswahl geeigneter Ausgangsstoffe sowie einer optimalen Trennstrategie eine besondere Bedeutung zu.Jeder Schritt jedes Proteinreinigungsprotokolls wird überwacht und das Gleichgewicht zwischen Reinigungsniveau und Ausbeute wird berücksichtigt.
Vorbereitende Schritte
Extraktion
Wenn das betreffende Protein nicht vom Organismus in die externe Lösung ausgeschieden wird, besteht der erste Schritt des Reinigungsprozesses darin, die Zellen, die das Protein enthalten, aufzubrechen. Abhängig von der Fragilität des Proteins und der Stabilität der Zellen kann eine der folgenden Methoden angewendet werden: wiederholtes Einfrieren und Auftauen, Ultraschallbehandlung, Hochdruckhomogenisierung (French Press), Mahlhomogenisierung (Perlmühle) und die Verwendung von Detergenzien (Die Permeabilisierung kann mit Lysozym (z. B. Triton X-100) und/oder Enzymen (z. B. Lysozym) erfolgen. Abschließend können Zelltrümmer mittels Differenzialzentrifugation entfernt werden.
Während der Zelllyse können freigesetzte Proteasen beginnen, Proteine in der Lösung zu verdauen. Wenn das Zielprotein also proteaseempfindlich ist, arbeiten Sie schnell und halten Sie den Extrakt kühl.Durch die Differenzialzentrifugation ist nach der Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit eine weitere Trennung mit höherer Kraft möglich, und das entstehende Pellet kann Zellkerne enthalten.
Ultrazentrifugation
Bei der Ultrazentrifugation handelt es sich um einen Prozess, bei dem Gemische unterschiedlicher Masse oder Dichte durch die Nutzung der Zentrifugalkraft getrennt werden. Wenn ein Behälter mit verschiedenen Proteinen oder anderen Partikeln bei hoher Geschwindigkeit rotiert, bewegen sich die größeren, kleineren und schwereren Partikel schneller nach außen als Partikel mit geringerer Masse. Durch diesen Vorgang entsteht ein Bodensatz aus bestimmten Partikeln, der sogenannte „Niederschlag“, während die nicht kompakten Partikel in der Flüssigkeit als „Überstand“ bezeichnet werden und aus dem Behälter entfernt werden können.
Die Ultrazentrifugation ist in der Biochemie für die effiziente Trennung von Biomakromolekülen und die Analyse ihrer physikalischen Eigenschaften äußerst wertvoll.
Durch die Saccharosegradientenzentrifugation wird ein linearer Konzentrationsgradient im Röhrchen erzeugt, sodass beim Zentrifugieren der Probe mit hoher Geschwindigkeit schwere Substanzen mit hohem Molekulargewicht schneller nach unten wandern als leichte Substanzen.
Reinigungsstrategie
Die Auswahl geeigneter Ausgangsmaterialien ist bei der Gestaltung eines Reinigungsprozesses von entscheidender Bedeutung. Bei Pflanzen oder Tieren sind bestimmte Proteine oft nicht gleichmäßig verteilt und weisen in bestimmten Organen oder Geweben höhere Konzentrationen auf. Die Verwendung von Geweben oder Organen mit höheren Proteinkonzentrationen kann dazu beitragen, das Volumen der Salzlösung zu reduzieren und so die Effizienz der Studie zu erhöhen.
Darüber hinaus kann das zu extrahierende Protein durch rekombinante DNA-Technologie verwendet werden, um Zellen zu entwickeln, die große Mengen des gewünschten Proteins produzieren (ein sogenanntes Expressionssystem).
Dadurch kann das Zielprotein markiert werden (z. B. mit einem His-Tag oder einem Strep-Tag), um die Reinigung zu erleichtern und so die Anzahl der erforderlichen Reinigungsschritte zu reduzieren. Im Allgemeinen können Proteine anhand ihres isoelektrischen Punkts, ihrer Größe bzw. ihres Molekulargewichts und ihrer Polarität/Hydrophobie getrennt werden.
AbschlussIn der heutigen wissenschaftlichen Forschung wirkt sich die genaue Trennung und Reinigung von Proteinen nicht nur auf die Zuverlässigkeit und Wirksamkeit der Forschungsergebnisse aus, sondern bestimmt auch die Entwicklung und das Anwendungspotenzial verwandter Technologien. Wie können Forscher also angesichts des wissenschaftlichen Fortschritts und der steigenden Nachfrage den Prozess der Proteinextraktion und -trennung vereinfachen und optimieren und gleichzeitig die Effizienz aufrechterhalten?
