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Genom oder Transkriptom? Der entscheidende Unterschied bei der Wahl der richtigen Assemblierungsmethode!
Mit der Entwicklung neuer Sequenzierungstechnologien ist die Transkriptomforschung in eine neue Ära eingetreten. Insbesondere zwischen 2008 und 2012 ermöglichte der deutliche Rückgang der Sequenzierungskosten die Zusammenstellung und Analyse der Transkriptome vieler Nicht-Modellorganismen. Dieser Wandel geht über die Feststellung phänotypischer Variationen in bestimmten Organismen hinaus und ermöglicht uns ein umfassenderes Verständnis der Vielfalt und der biologischen Mechanismen des Lebens auf der Erde.
„Der größte Nutzen der Transkriptom-Assemblierung ist ihr Potenzial, neue Proteine und ihre Isoformen aufzudecken, die bei bestimmten biologischen Phänomenen eine Schlüsselrolle spielen könnten.“
Es gibt zwei Hauptmethoden zur Transkriptom-Assemblierung: De-novo-Assemblierung und referenzbasierte Assemblierung. Für Nicht-Modellorganismen, für die noch kein vollständiges Genom erstellt wurde, ist die De-novo-Transkriptom-Assemblierung offensichtlich die geeignetere Wahl. Dieser Ansatz ist nicht auf frühere Genomsequenzen angewiesen und ermöglicht es den Forschern, unbekannte Informationen zur Gentranskription zu erforschen.
De novo vs. referenzbasierte Assembly
In der Vergangenheit beruhte die Analyse von Transkriptomdaten hauptsächlich auf dem Vergleich mit vorhandenen Referenzgenomen. Allerdings deckt dieser Ansatz möglicherweise nicht alle strukturellen mRNA-Varianten ab, insbesondere wenn alternatives Spleißen beteiligt ist, und viele Transkriptvarianten werden möglicherweise übersehen, weil sie nicht diskontinuierlich dem Genom zugeordnet werden können. Daher ist es auch bei einem Referenzgenom erforderlich, eine De-novo-Assemblierung durchzuführen, da die neue Assemblierung Transkripte wiederherstellen kann, die im Referenzgenom fehlen.
Transkriptom- und Genomassemblierung
Die Abdeckungstiefe des Transkriptoms kann den Expressionsgrad des Gens direkt widerspiegeln, während die Abdeckungstiefe des Genoms normalerweise durch sich wiederholende Sequenzen beeinflusst wird. Darüber hinaus besteht eine der größten Herausforderungen bei der Transkriptomassemblierung darin, dass verschiedene Transkriptvarianten im selben Gen Exons gemeinsam haben können, was ihre Identifizierung erschwert.
Methoden zur Transkriptom-Assemblierung
RNA-SequenzNach der RNA-Extraktion und -Reinigung werden die Proben zur Reverse-Transkription an eine Hochdurchsatz-Sequenzierungseinrichtung gesendet, um eine cDNA-Bibliothek zu erhalten. Je nach Plattform werden diese cDNAs in bestimmte Längen geschnitten und dann mithilfe unterschiedlicher Technologien sequenziert, darunter 454-Sequenzierung, Illumina und SOLiD.
Montagealgorithmus
Die Sequenzdaten der Transkripte werden mithilfe eines Kurzlese-Transkript-Assemblierungsprogramms zu Transkripten zusammengesetzt. Da Transkripte zwar ähnlich sein können, aber Unterschiede in den Aminosäuren aufweisen, können diese Unterschiede unterschiedliche Proteinisoformen widerspiegeln. Zur Durchführung dieses Vorgangs können zahlreiche Assemblierungprogramme verwendet werden, die Transkriptomassemblierung bringt jedoch zahlreiche einzigartige Herausforderungen mit sich.
„Die meisten Assembler für Kurztexte folgen zwei grundlegenden Algorithmen: dem Overlap-Graph und dem De-Bruijn-Graph, wobei der De-Bruijn-Graph aufgrund seines relativ geringen Rechenleistungsbedarfs vorzuziehen ist.“
Funktionale Hinweise
Die funktionelle Annotation gesammelter Transkripte kann ein vertieftes Verständnis ihrer potenziellen biologischen Funktionen ermöglichen. Mit Tools wie Blast2GO können nicht annotierte Sequenzdaten auf Grundlage der Genontologie gewonnen werden. Dieser Prozess kann dabei helfen, die biologischen Prozesse, an denen die Transkripte beteiligt sind, und ihre molekularen Funktionen zu identifizieren.
Validierung und Qualitätskontrolle
Da es selten vorkommt, dass ein gutes Referenzgenom zur Verfügung steht, muss die Qualität der zusammengestellten Sequenz durch einen Vergleich mit den Rohdaten überprüft werden. Das Filtern kurzer Sequenzen ist auch deshalb notwendig, weil sich diese kurzen Sequenzen im Allgemeinen nicht effektiv in funktionelle Proteine falten lassen.
Wählen Sie einen Monteur
Auf dem Markt sind zahlreiche Assemblierungssoftwares erhältlich, mit denen Transkriptome erstellt werden können. Beispielsweise verfügen Tools wie SOAPdenovo-Trans und Trinity über einzigartige Funktionen. Diese Programme können nicht nur Transkripte effizient zusammenstellen, sondern auch unterschiedliche Spleißereignisse und Genexpressionsniveaus berücksichtigen.
In diesem sich rasch entwickelnden Bereich hängt die Wahl der Methode zur Genom- oder Transkriptomassemblierung letztendlich von den Bedürfnissen des Forschers und den Eigenschaften des untersuchten Organismus ab. Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile. Haben die Forscher einen Forschungspfad gewählt, der ihren Bedürfnissen am besten entspricht?
