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Die Magie amplifizierter Fragmente: Wie findet man in der genetischen Forschung wichtige Hinweise?
In der Molekularbiologie ist ein Amplikon ein DNA- oder RNA-Abschnitt, der durch ein Amplifikations- oder Replikationsereignis entsteht. Diese Fragmente können mithilfe verschiedener Methoden wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder der Ligase-Kettenreaktion (LCR) künstlich erzeugt werden oder das Ergebnis natürlicher Genduplikationen sein. Unter Amplifikation ist hier die Herstellung mehrerer Kopien eines genetischen Abschnitts oder einer Zielsequenz zu verstehen, und insbesondere bezieht sich der Begriff auf den amplifizierten Abschnitt selbst.
Die künstliche Amplifikation findet Anwendung in der Forschung, Forensik und Medizin, beispielsweise zum Erkennen und Quantifizieren infektiöser Krankheitserreger, zur Identifizierung menschlicher Überreste und zur Extraktion von Genotypen aus menschlichem Haar.
Natürliche Genduplikationen spielen eine wichtige Rolle in der Evolution und werden mit mehreren Formen von Krebs beim Menschen in Verbindung gebracht, darunter dem primären mediastinalen B-Zell-Lymphom und dem Hodgkin-Lymphom. Daher kann sich Amplikon in diesem Zusammenhang nicht nur auf bestimmte chromosomale DNA-Segmente beziehen, sondern auch auf Segmente, die herausgeschnitten, amplifiziert und an anderer Stelle im Genom wieder eingefügt wurden, sowie auf extrachromosomale DNA-Segmente, die als Diminigene bezeichnet werden. Jedes Fragment kann aus einem oder mehreren Genen bestehend.
Die Amplifikation der durch diese amplifizierten Fragmente kodierten Gene erhöht im Allgemeinen die Transkriptionseffizienz dieser Gene, was letztendlich zu einer Erhöhung der Menge der verwandten Proteine führt.
Struktur des amplifizierten Fragments
Das Amplikon ist normalerweise eine direkte Wiederholung (Kopf-Schwanz) oder eine umgekehrte Wiederholung (Kopf-Kopf oder Schwanz-Schwanz) einer genetischen Sequenz und kann eine lineare oder kreisförmige Struktur aufweisen. Die Struktur des zirkulären Amplikons besteht aus unvollständigen invertierten Wiederholungen, die sich bedingt zu einem Kreis zusammenfügen, der vermutlich aus einem linearen Vorgängeramplikon entstanden ist. Bei der künstlichen Amplifikation hängt die Länge des amplifizierten Fragments vom Ziel des Experiments ab.
Fortschritte in der Verstärkungstechnologie
Die Analyse amplifizierter Fragmente wurde durch die Entwicklung von Amplifikationsmethoden wie PCR möglich, und es sind immer mehr hochwertige und durchsatzstarke DNA-Sequenzierungstechnologien entstanden, wie z. B. die Ionen-Halbleiter-Sequenzierungstechnologie, die oft Die Marke des Entwicklers heißt Ion Torrent. Diese Sequenzierungstechnologien haben es möglich gemacht, Amplikonfragmente in den Bereichen der Genombiologie und Genetik zu untersuchen, einschließlich der Krebsgenetikforschung, phylogenetischer Studien und der Humangenetik. Nehmen wir als Beispiel das 16S rRNA-Gen. Dieses Gen ist Teil des Genoms aller Bakterien und Archaeen und hochkonserviert. Durch Vergleich der Sequenz des amplifizierten Fragments mit der bekannten Sequenz können Bakterien klassifiziert werden.
Fast jede Sequenzierung amplifizierter Fragmente erfordert eine Quantifizierung des amplifizierten Produkts. Dazu sind normalerweise ein Erfassungsschritt und ein Nachweisschritt erforderlich. Die spezifischen Durchführungsmethoden variieren.
Anwendung amplifizierter Fragmente
Mithilfe der PCR kann das Geschlecht einer menschlichen DNA-Probe bestimmt werden. Durch Auswahl der Insertionsstelle des Alu-Elements zur Amplifikation und Bewertung der Fragmentgröße verwendet der Geschlechtstest AluSTXa, um dem X-Chromosom zu entsprechen, und AluSTYa, um dem Y-Chromosom zu entsprechen. Durch dieses Design kann die Fehlerwahrscheinlichkeit effektiv reduziert werden. Wenn die homologe Region amplifiziert wird, erzeugt das eingefügte Chromosom größere Fragmente. Männchen lassen sich daran erkennen, dass sie über zwei DNA-Amplifikationsfragmente verfügen, während Weibchen nur über ein Amplifikationsfragment verfügen. Das Methodenpaket für diese Methode umfasst ein Primerpaar für Amplifikationsstellen und selektive Reagenzien für die Polymerase-Kettenreaktion. LCR wurde auch bei der Tuberkulosediagnose als Test eingesetzt, wobei die Zielsequenz, die das Proteinantigen B enthält, von vier Oligonukleotidprimern für den Sinn- bzw. Rückwärtsstrang angesteuert wird.
Die amplifizierten Produkte oder Fragmente werden durch verschiedene Nachweis- und Erfassungsschritte ausgewertet. Mit der Entwicklung der Amplikonsequenzierung werden die verschiedenen Amplikonfragmente, die aus einer gemeinsamen Probe erzeugt werden, verknüpft und sequenziert, gefolgt von einer Qualitätskontrollklassifizierung und schließlich wird die Anzahl des gleichen Typs berechnet, um ihre relative Häufigkeit in der Probe widerzuspiegeln.
Mit dem Fortschritt der Technologie sind amplifizierte Fragmente zu einem unverzichtbaren Teil der heutigen genetischen Forschung geworden. Aber verstehen wir in diesem sich rasch entwickelnden Bereich das Potenzial amplifizierter Fragmente vollständig?
