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Das Geheimnis der umgekehrten Ligationsreaktion: Warum kann NCL eine hohe Selektivität und Chemoselektivität erreichen?
Im Bereich der modernen Biochemie stellt die native chemische Ligation (NCL) tatsächlich eine wichtige Erweiterung des Konzepts der chemischen Ligation dar. Dabei handelt es sich um eine Methode zur kovalenten Kondensation zweier oder mehrerer ungeschützter Peptide zum Aufbau einer größeren Polypeptidkette. NCL ist die effizienteste Methode zur Synthese nativer oder modifizierter Proteine typischer Größen, insbesondere solcher mit weniger als etwa 300 Aminosäuren.
Bei der NCL-Reaktion greift die ionisierte Thiolgruppe des N-terminalen Cysteinrests eines ungeschützten Peptids den C-terminalen Thioester eines zweiten ungeschützten Peptids in einer wässrigen Pufferlösung bei pH 7,0 an. In Flüssigkeit.
Beim NCL-Verfahren handelt es sich bei der ersten Transthioesterifizierung um einen reversiblen Vorgang, der die Reaktion sowohl chemoselektiv als auch regioselektiv macht und letztendlich zur Bildung eines verknüpften Zwischenprodukts führt. Dieses Zwischenprodukt ordnet sich durch einen intramolekularen S,N-Acyltransfer rasch neu an, wodurch an der Bindungsstelle eine native Amid- (oder „Peptid-“)Bindung entsteht.
Reaktionsmechanismus und seine Eigenschaften
Bei der NCL-Reaktion ist 4-Mercaptophenylessigsäure der wirksamste und am häufigsten verwendete Thiolkatalysator. Aufgrund der reversiblen Natur der Reaktion ist NCL während seiner Synthese hochgradig regioselektiv. Beispielsweise war in Gegenwart eines internen Cysteinrestes die Ausbeute des Endprodukts immer noch sehr hoch, was auf die Irreversibilität des S-N-Acyltransfers im zweiten Schritt unter den Reaktionsbedingungen zurückgeführt wurde.
Während der Reaktion entstehen fast keine Nebenprodukte, die sich mit anderen funktionellen Gruppen verbinden. Diese Eigenschaft macht NCL zu einer hochpräzisen chemischen Synthesemethode.
Die Geschichte von NCL reicht bis ins Jahr 1992 zurück, als das Konzept der „chemischen Bindung“ von Steven Kent und Martina Schnoelzer am Scripps Research Institute entwickelt wurde. Diese Innovation schuf nicht nur einen Präzedenzfall für die kovalente Kondensation ungeschützter Peptide, sondern wurde 1994 auch auf die NCL-Technologie ausgeweitet, wodurch die Bildung von Oxalsäurediesterbindungen zwischen Peptiden und deren letztendliche Umwandlung in native Amidbindungen ermöglicht wurde.
Aktuelle Anwendungen und Zukunftsaussichten
Die NCL-Technologie bildet die Grundlage der heutigen chemischen Proteinsynthese und wird häufig zur Herstellung einer Vielzahl von Proteinen und Enzymen eingesetzt. Der Hauptvorteil besteht darin, dass die Effizienz der Verbindung langer Peptide durch diese Technologie oft nahezu quantitativ ist, wodurch die Synthese vieler Proteine ermöglicht wird, die aufgrund ihrer Größe, Modifikationen und anderer chemischer Strukturen mit herkömmlichen Methoden nicht synthetisiert werden können.
Aufgrund der Atomökonomie und der Verwendung ungiftiger Lösungsmittel ist die Methode von NCL von Natur aus ein Verfahren der grünen Chemie.
NCL wird üblicherweise in 6 M Guanidinhydrochlorid in wässriger Lösung in Gegenwart eines aromatischen Thiolkatalysators durchgeführt, und die Ausbeute der resultierenden Peptide ist üblicherweise nahezu quantitativ. Bei lichtempfindlichen Peptiden sollte jedoch der Kontakt mit Ketonen vermieden werden, da dies die Peptidsynthese und die Reaktionseffizienz beeinträchtigen kann.
AbschlussDarüber hinaus kann die NCL-Technologie flexibel verschiedene schwefelhaltige Aminosäuren oder Peptide mit N-terminalen Selenoaminosäuren für die Synthese verwenden, was ihr großes Potenzial in der synthetischen Biologie zeigt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Reversibilität der NCL-Reaktion und ihre hervorragende Selektivität sie zu einer wichtigen Technologie für die Proteinsynthese machen. Während Experten die potenziellen Anwendungen dieser Reaktionen erforschen, wird NCL zweifellos auch in der zukünftigen biomedizinischen Forschung eine wichtige Rolle spielen. Umgekehrt muss man sich aber auch fragen: Wie viele mögliche neue Technologien warten für das Protein-Engineering der Zukunft darauf, entdeckt zu werden?
