Language
Country/Area
No result found
Der Ursprung der Sanger-Sequenzierung: Warum hat diese Technologie die Geschichte der DNA-Forschung verändert?
1977 veröffentlichten der britische Wissenschaftler Frederick Sanger und seine Kollegen erstmals die nach ihm benannte Sanger-Sequenzierungsmethode. Diese Methode revolutionierte schnell die Bereiche Genomik und Molekularbiologie und wurde im späten 20. Jahrhundert zur am häufigsten verwendeten Methode. Eine der DNA-Sequenzierungstechnologien . Mithilfe der Sanger-Sequenzierungsmethode konnten Wissenschaftler die Geheimnisse der DNA mit beispielloser Genauigkeit und Geschwindigkeit entschlüsseln.
Die Sanger-Sequenzierung basiert auf dem zufälligen Einbau kettenabbrechender Dideoxynukleotide (ddNTPs) während der DNA-Replikation in vitro, wodurch eine Auflösung der DNA-Sequenz ermöglicht wird.
Die Schlüsseltechnologie der Sanger-Sequenzierung ist die Elektrophorese, die es Wissenschaftlern ermöglicht, DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge aus komplexen DNA-Proben zu trennen. Dieser Prozess erfordert normalerweise eine einzelsträngige DNA-Vorlage, einen Satz DNA-Primer sowie vier normale Desoxyribonukleotide (dNTPs) und vier markierte Didesoxynukleotide (ddNTPs). Diese ddNTPs können zur Erkennung in automatisierten Sequenzierungsinstrumenten radioaktiv oder fluoreszierend markiert werden.
Die Entwicklung dieser Technologie beschränkt sich nicht auf theoretische Innovationen. Mit der Markteinführung der ersten kommerziellen automatisierten Geräte im Jahr 1987 und der darauffolgenden Entwicklung einer effizienteren automatisierten Kapillarelektrophorese-Technologie hielt die Sanger-Sequenzierung schnell Einzug in zahlreiche Labore. Mit der fortschreitenden Digitalisierung und Automatisierung hat diese Technologie in den letzten Jahrzehnten rasch an Popularität gewonnen.
Obwohl die Rolle der Sanger-Sequenzierung bei groß angelegten Genomanalysen mit dem Aufkommen der Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation abgenommen hat, hat sie in kleinen Projekten und bei der Validierung von Deep-Sequencing-Ergebnissen immer noch ihren Platz.
Derzeit wird die Sanger-Sequenzierung im Bereich der öffentlichen Gesundheit noch häufig eingesetzt, beispielsweise im CaliciNet-Netzwerk des CDC zur Überwachung von Norovirus-Ausbrüchen. Auch im Kampf gegen die COVID-19-Epidemie hat diese Technologie ihre enorme Vitalität unter Beweis gestellt. Durch die schnelle und genaue Sequenzierung der relevanten Gene von SARS-CoV-2 hat sie wertvolle Daten zur Reaktion auf die Gesundheitskrise geliefert.
Technische Grundlagen und Änderungen
Bei der Sanger-Sequenzierung handelt es sich im Wesentlichen um eine Kettenabbruchmethode. Bei der Sequenzierung wird die DNA-Vorlage in vier unabhängige Reaktionen aufgeteilt und zusätzlich zu den vier grundlegenden Desoxyribonukleotiden wird jeder Reaktion nur ein markiertes Didesoxynukleotid hinzugefügt. Diesen kettenabbrechenden ddNTPs fehlt die 3'-OH-Gruppe, die zur Bildung einer Phosphodiesterbindung erforderlich ist, was dazu führt, dass die DNA-Polymerase im Prozess ins Stocken gerät.
Die Einführung lumineszierender ddNTPs ermöglicht die Messung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge in einem Elektrophoresetank. Dadurch entfällt die Notwendigkeit mehrerer Reaktionen und die Sequenzierungseffizienz wird verbessert.
Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung der Technologie hat sich die Dye-Terminator-Sequenzierung zum Mainstream der automatisierten Sequenzierung entwickelt. Die Hauptvorteile dieser Methode bestehen darin, dass sie den Automatisierungsgrad der Reaktion erhöht, den Personalbedarf reduziert und die Sequenzierung mit einer einzigen Reaktion abschließt, wodurch die Probenverarbeitungszeit minimiert wird. Dies bringt jedoch auch gewisse Nachteile mit sich. So kann es beispielsweise durch die ungleichmäßige Verteilung der Fluoreszenzfarbstoffe zu unterschiedlichen Peakhöhen im Elektrophoresespektrum kommen, was wiederum die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigt.
Aktueller Challenge-Status
Auch wenn die Sanger-Sequenzierung in der Vergangenheit ein großer Erfolg war, bleiben einige Herausforderungen bestehen. Beispielsweise ist die Qualität des Sequenzierungsendes, insbesondere der ersten Sequenz, häufig mangelhaft, und aufgrund des Einflusses des Klonierungsvektors können in den Sequenzierungsfragmenten unnötige Sequenzen auftreten. Darüber hinaus hat die Nachfrage nach einer schnellen und effizienten Sequenzierung spezifischer Gene Wissenschaftler dazu veranlasst, nach integrierten Lösungen wie etwa der integrierten Mikrofluidik-Technologie zu suchen.
Die mikrofluidische Sanger-Sequenzierungstechnologie wird traditionelle Sequenzierungsschritte integrieren. Diese Innovation soll die Qualität und Effizienz der Sequenzierung verbessern und den Einsatz teurer Reagenzien sowie die Arbeitsbelastung der Experimentatoren reduzieren.
Vor diesem Hintergrund wird der Bedarf der Wissenschaftler an neuen Technologien immer dringlicher. Mit dem Aufkommen der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie wurde der Status der Sanger-Sequenzierung in Frage gestellt, ihre Anwendung in bestimmten Szenarien kann jedoch nicht ignoriert werden. Auf jeden Fall stellt die Einführung der Sanger-Sequenzierung zweifellos eine große Reform in der Geschichte der DNA-Sequenzierung dar, und die Vorteile dieser Technologie bleiben in vielerlei Hinsicht einzigartig.
Wie wird sich vor diesem Hintergrund die Rolle der Sanger-Sequenzierung in der zukünftigen Datenwissenschaft und der öffentlichen Gesundheitsforschung entwickeln?
