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Die Geheimnisse der Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion: Wie kann man die Genexpression durch RNA aufdecken?
Die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine Labortechnik, die die Transkription von RNA in DNA (in diesem Zusammenhang komplementäre DNA oder cDNA genannt) und die Amplifikation eines spezifischen DNA-Ziels kombiniert. Dieser Prozess verwendet die Polymerase-Kettenreaktion Reaktion (PCR). Diese Technik wird hauptsächlich verwendet, um die Menge spezifischer RNA durch Überwachung der Fluoreszenz der Amplifikationsreaktion zu messen. Diese Technik wird als Echtzeit-PCR oder quantitative PCR (qPCR) bezeichnet. In der wissenschaftlichen Literatur wird der Begriff RT-PCR von manchen Autoren manchmal verwirrenderweise als Bezeichnung für Echtzeit-PCR verwendet. In diesem Artikel bezeichnen wir RT-PCR speziell als Reverse-Transkriptase-PCR.
Aufgrund seiner Einfachheit, hohen Spezifität und Empfindlichkeit wurde RT-PCR in einer großen Vielfalt von Experimenten eingesetzt, von der Quantifizierung von Hefezellen in Wein bis zum Nachweis infektiöser Krankheitserreger.
Prinzipien und Anwendungen der RT-PCR
Das Prinzip der RT-PCR besteht darin, zunächst die RNA-Vorlage in cDNA umzuwandeln, die dann mittels PCR exponentiell amplifiziert wird. Diese revolutionäre Änderung im Verfahren ermöglicht es uns, Transkripte nahezu aller Gene zu erkennen und Proben zu amplifizieren, wodurch die großen Mengen an Ausgangsmaterial entfallen, die beim Northern Blotting erforderlich sind.
RT-PCR hat sich zu einer der wichtigsten Techniken von der Genexpressionsanalyse bis zur Diagnose infektiöser Krankheitserreger entwickelt. Beispielsweise untersuchen Wissenschaftler, wie sich RT-PCR für Krebstests einsetzen lässt, um die Prognose zu verbessern und den Behandlungserfolg zu überwachen.
Zirkulierende Tumorzellen produzieren beispielsweise je nach Krebsart einzigartige mRNA-Transkripte, und mittels RT-PCR können die Expressionsniveaus dieser Transkripte analysiert werden.
Technische Entwicklung der RT-PCR
Seit der Einführung des Northern Blotting im Jahr 1977 hat sich die RT-PCR zu einer beliebten Methode für die RNA-Erkennung und -Quantifizierung entwickelt, obwohl die Technik ihre Nachteile bei der RNA-Quantifizierung hat, wie z. B. den Zeitaufwand und den Bedarf an großen RNA-Mengen. PCR von Kary Mullis im Jahr 1983. Die Methode der Wahl zur Quantifizierung. Dieser Prozess erfordert nicht nur keine Nachbearbeitung, sondern kann auch die RNA-Häufigkeit mehr als 107 Mal messen und so weitere Qualitäts- und Quantitätsdaten liefern.Derzeit gibt es in der RT-PCR-Technologie verschiedene Betriebsarten: One-Stop und Two-Step. Bei der zweistufigen RT-PCR müssen die Reverse Transkription und die PCR-Amplifikation in unterschiedlichen Reagenzgläsern durchgeführt werden, während die One-Stop-RT-PCR in einem Reagenzglas durchgeführt werden kann. Obwohl die One-Stop-Methode für eine schnelle Erkennung bequemer ist, besteht bei wiederholten Tests die Gefahr einer Verschlechterung der Probenqualität.
Herausforderungen und zukünftige Richtungen der RT-PCR
Obwohl die RT-PCR-Technologie viele Vorteile bietet, gibt es dennoch einige Herausforderungen. Beispielsweise führt das exponentielle Wachstum der komplementären DNA (cDNA) nach der Reversen Transkription während mehrerer PCR-Zyklen zu einer ungenauen Endpunktquantifizierung, während die qRT-PCR dieses Problem durch die zusätzliche Fluoreszenzüberwachungstechnologie überwindet. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit können außerdem selbst kleinste Mengen einer DNA-Verunreinigung die Ergebnisse verfälschen. Daher ist es wichtig, Variationsquellen in der Technologie einzuplanen und zu entwerfen.
Beispielsweise kann das Hinzufügen einer bekannten Menge RNA als Referenzprobe Forschern dabei helfen, quantitative Kontrollen und Analysen durchzuführen.
Dank der kontinuierlichen technologischen Weiterentwicklung verfügt RT-PCR über ein breites Anwendungspotenzial in der genetischen Diagnostik, Krebserkennung und Früherkennung von Krankheiten. Es ist abzusehen, dass diese Technologie in der künftigen wissenschaftlichen Forschung eine wichtigere Rolle beim Verständnis von Veränderungen der Genexpression und den ihnen zugrunde liegenden Mechanismen spielen wird.
Wie wird die Anwendung dieser Technologie in der genetischen Biologie durch die eingehende Untersuchung der RT-PCR-Technologie unser Verständnis der Lebensprozesse weiter verändern?
