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Gesamtgenom-Sulfitsequenzierung: Wie können die Geheimnisse der Genregulation gelüftet werden?
Im Bereich der genetischen Forschung spielt der Methylierungszustand der DNA eine entscheidende Rolle, insbesondere bei der Genregulation und der Transkriptionsaktivität. Die Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms ist eine fortschrittliche Technologie, mit der der Methylierungsstatus von DNA mit einer einzigen Cytidinauflösung bestimmt werden kann. Seit 2009 hat sich diese Technologie schrittweise zu einem zentralen Instrument der Genomforschung entwickelt. Durch die Kombination einer Natriumsulfitbehandlung von DNA mit Hochdurchsatzsequenzierung konnten viele Geheimnisse der Genregulation gelüftet werden.
Technologische Fortschritte bei der Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms haben es uns ermöglicht, den Methylierungsstatus von fast 95 % des Cytidins in unserer DNA umfassend zu beurteilen.
Technische Geschichte
Vor der Einführung der Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms stützte man sich bei der Analyse der genomischen Methylierung hauptsächlich auf frühe unspezifische und diskriminierende Methoden wie Papierchromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, mit denen die Methylierungs-DNA nicht effektiv amplifiziert werden konnte. 1970 entdeckten Wissenschaftler, dass die Behandlung von DNA mit Natriumsulfit Cytidin zu Uracil desaminieren kann. Diese Entdeckung öffnete ein Fenster zur Erforschung der DNA-Methylierung. In den folgenden Jahrzehnten nutzten Forscher dieses Prinzip, um herauszufinden, dass unmethyliertes Cytidin anders reagiert als 5-Methylcytidin, wodurch es möglich wurde, chemische Veränderungen in der DNA festzustellen.
Technische Methoden
Der Bisulfitsequenzierungsprozess des gesamten Genoms umfasst normalerweise die folgenden Schritte: Ziel-DNA-Extraktion, Bisulfitumwandlung, Bibliotheksamplifikation und bioinformatische Analyse. Diese Schritte können von unterschiedlichen Sequenzierungssystemen und Analysetools abhängen und technische Parameter anpassen, um die Abdeckung und Effizienz des Experiments zu optimieren.
DNA-ExtraktionWährend der Bibliotheksvorbereitung durchlaufen DNA-Moleküle Schritte wie Fragmentierung, Endreparatur, dA-Addition und Adapterligation. Diese Schritte stellen sicher, dass sich die DNA-Moleküle vor der Bisulfitbehandlung und der Bibliotheksamplifikation in optimalem Zustand befinden.
Sulfit-Umwandlung
In diesem Schritt wird die adapterligierte DNA-Probe mit Natriumsulfit behandelt, um unmethyliertes Cytidin in Uracil umzuwandeln. Dieser Umwandlungsprozess ermöglicht es uns, zwischen 5-Methylcytidin und Uracil zu unterscheiden und so Zielstellen für die Methylierung zu identifizieren.
Bibliotheksverstärkung und bioinformatische Analyse
Nach der Bisulfit-Umwandlung erzeugt eine weitere Bibliotheksamplifikation DNA-Fragmente mit spezifischen Markierungen. Gleichzeitig werden mithilfe der bioinformatischen Analyse verschiedene Methylierungsmerkmale der amplifizierten Bibliothek analysiert, wodurch letztendlich eine Methylierungskarte des gesamten Genoms erstellt wird.
Die Untersuchung der globalen Genommethylierung hilft, DNA-Methylierungsstellen zu identifizieren, die mit der spezifischen Genexpression in Zusammenhang stehen, und die ihnen zugrunde liegenden biologischen Mechanismen aufzudecken.
Anwendungen und Herausforderungen
Mit der Förderung der Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms hat diese Technologie großes Potenzial in der epigenetischen Grundlagenforschung und bei epidemiologischen Untersuchungen gezeigt. Die Forscher nutzten diese Technologie, um das erste menschliche DNA-Methylom zu etablieren und entdeckten dabei die Allgegenwart der Nicht-CG-Methylierung. Die weitverbreitete Anwendung dieser Technologie wird jedoch immer noch durch die Kosten, Schwierigkeiten bei der Dateninterpretation und mögliche technische Verzerrungen eingeschränkt.
Zukünftige Richtungen
Da die Biotechnologie immer weiter fortschreitet, wird sich die Forschung künftig darauf konzentrieren, die Kosten der Bisulfit-Gesamtgenomsequenzierung zu senken und die Genauigkeit der Datenanalyse zu verbessern. Darüber hinaus wird erwartet, dass die Methode durch ihre Anwendung in der Krebsdiagnose und in der Forensik weitere Erkenntnisse über die Zusammenhänge zwischen Methylierung und nachfolgenden Erkrankungen liefert.
Haben Sie in diesem Zeitalter des raschen technologischen Wandels schon einmal darüber nachgedacht, welche Auswirkungen die Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms auf die zukünftige Genregulationsforschung und biomedizinische Entwicklung haben wird?
