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Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de una sola molécula: ¿Cómo revelar el misterio de las biomoléculas?
En biofísica, la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de moléculas individuales (smFRET) se está convirtiendo rápidamente en una tecnología clave que puede medir distancias entre biomoléculas individuales con una precisión de 1 a 10 nanómetros. Esta técnica no sólo proporciona una visión más cercana de las moléculas, sino que también revela muchos comportamientos dinámicos que no pueden analizarse con mediciones colectivas tradicionales.
El poder de la FRET de molécula única reside en su capacidad de resolver la señal FRET de cada molécula, revelando así su información cinética.
Utilizando la tecnología FRET, los investigadores pueden observar los procesos dinámicos dentro y entre las moléculas, como el plegamiento y desplegamiento del ADN, el ARN y las proteínas. Este método es de gran importancia para aplicaciones como la detección química y biológica, porque a través de la observación a nivel de molécula individual, los científicos pueden obtener los datos más realistas del comportamiento molecular.
Métodos de medición
Las mediciones de FRET de moléculas individuales generalmente se realizan mediante microscopía de fluorescencia, donde las moléculas pueden estar inmovilizadas en una superficie o difundirse libremente. Los investigadores utilizan una fuente de luz potente, como un láser, para excitar el par FRET, generando suficiente señal fluorescente para la detección de una sola molécula. Para reducir el ruido, los estudios a menudo combinan la microscopía multifotónica de campo completo con la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF).
Los cambios en la señal FRET de una sola molécula ayudan a revelar el comportamiento dinámico del sistema en equilibrio.
En los experimentos de inmovilización de superficie, las biomoléculas que llevan etiquetas fluorescentes se inmovilizan en la superficie del vidrio de cubierta y se recogen continuamente imágenes fluorescentes. Estos experimentos permiten observar cómo muchas moléculas cambian simultáneamente durante un largo tiempo hasta que se extingue la fluorescencia. Por el contrario, la smFRET de difusión libre se puede observar a medida que las moléculas en la muestra líquida se difunden naturalmente, lo que hace que el seguimiento de los cambios sea más flexible.
Análisis de datosLos datos smFRET generalmente implican trazas de tiempo de un sistema de dos tintes, las intensidades de fluorescencia del donante y del aceptor. Los investigadores utilizan filtros ópticos o divisores de haz para separar las emisiones de los dos colorantes y luego se calculan los datos para obtener la eficiencia FRET. Dado que los datos pueden contener señales de etiquetado o agregación incompletos, generalmente se requieren diversos programas de análisis complejos para garantizar la precisión de los datos.
El control del ruido también es una parte importante del procesamiento de datos. El ruido detectado puede provenir de la lectura de la cámara, del ruido del obturador y de variaciones en la propia muestra, por lo que es fundamental eliminar los datos no válidos y mejorar la relación señal-ruido.
Identificación de estados y análisis de tasasSe han desarrollado muchos algoritmos para analizar datos smFRET; los más utilizados incluyen el umbral y los modelos ocultos de Markov (HMM). Estos métodos permiten identificar transiciones de estados a partir de trayectorias temporales y calcular además las constantes de tasa de transferencia entre estados. Este análisis es crucial para comprender cómo las moléculas interactúan y se transforman en el tiempo y el espacio.
A través de smFRET, los científicos pueden observar pequeños cambios en la estructura y la dinámica molecular desde una perspectiva completamente nueva.
La tecnología de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de una sola molécula continúa ampliando nuestra comprensión de los sistemas biológicos y su potencial en la biomedicina y la ciencia de los materiales es cada vez más reconocido. Con el continuo avance de la tecnología, podremos explorar los misterios del mundo molecular con mayor precisión. ¿Cambiará esto la dirección de nuestra investigación en el campo de las ciencias biológicas?
