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Los secretos de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa: ¿Cómo revelar la expresión genética a través del ARN?
La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) es una técnica de laboratorio que combina la transcripción de ARN en ADN (en este caso llamado ADN complementario o ADNc) y la amplificación de un objetivo de ADN específico. Este proceso utiliza la reacción en cadena de la polimerasa. (PCR). Esta técnica se utiliza principalmente para medir la cantidad de ARN específico mediante el seguimiento de la fluorescencia de una reacción de amplificación, denominada PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). En la literatura científica, la RT-PCR resulta a veces confusa ya que algunos autores la utilizan para referirse a la PCR en tiempo real. En este artículo, nos referimos a la RT-PCR específicamente como PCR con transcripción inversa.
Debido a su simplicidad, alta especificidad y sensibilidad, la RT-PCR se ha utilizado en una amplia gama de experimentos, desde la cuantificación de células de levadura en el vino hasta la detección de patógenos infecciosos.
Principios y aplicaciones de RT-PCR
El principio de la RT-PCR es convertir primero la plantilla de ARN en ADNc y luego usar la PCR para la amplificación exponencial. Este cambio revolucionario en el proceso nos permite detectar transcripciones de prácticamente cualquier gen y lograr la amplificación de la muestra, eliminando las grandes cantidades de material de partida necesarias cuando se utiliza la transferencia Northern.
Desde el análisis de la expresión genética hasta el diagnóstico de patógenos infecciosos, la RT-PCR se ha convertido en una de las tecnologías más importantes. Por ejemplo, los científicos están estudiando cómo se puede utilizar la RT-PCR para la detección del cáncer con el fin de mejorar el pronóstico y controlar la respuesta al tratamiento.
Por ejemplo, las células tumorales circulantes producen transcripciones de ARNm únicas según el tipo de cáncer, y la RT-PCR puede analizar los niveles de expresión de estas transcripciones.
Evolución tecnológica de la RT-PCR
Desde que se introdujo por primera vez la transferencia Northern en 1977, la RT-PCR se ha convertido en un método popular para la detección de ARN y el método preferido para la cuantificación. Este proceso no sólo no requiere posprocesamiento, sino que puede medir más de 107 veces más abundancia de ARN, proporcionando además datos de calidad y cantidad.
En la actualidad, la tecnología RT-PCR ha desarrollado diferentes modos de operación de una sola parada y de dos pasos. La RT-PCR de dos pasos requiere transcripción inversa y amplificación por PCR en diferentes tubos de ensayo, mientras que la RT-PCR de una parada se puede completar en un solo tubo de ensayo. Aunque el método de una sola parada es más conveniente para una detección rápida, es susceptible a la degradación de la muestra durante las pruebas repetidas.
Desafíos y direcciones futuras de la RT-PCR
Aunque la tecnología RT-PCR tiene muchas ventajas, todavía enfrenta algunos desafíos. Por ejemplo, en múltiples ciclos de PCR, el crecimiento exponencial del ADN complementario (ADNc) después de la transcripción inversa produce una cuantificación del punto final inexacta, mientras que qRT-PCR supera este problema debido a la adición de tecnología de monitoreo de fluorescencia. Además, la alta sensibilidad significa que incluso pequeñas cantidades de contaminación del ADN pueden sesgar los resultados. Por lo tanto, es fundamental planificar y diseñar para las fuentes de variación de la tecnología.
Por ejemplo, agregar una cantidad conocida de ARN como muestra de referencia puede ayudar a los investigadores a realizar control y análisis cuantitativos.
Con la continua evolución de la tecnología, la RT-PCR tiene un amplio potencial de aplicación en el diagnóstico genético, la detección del cáncer y la detección temprana de enfermedades. Es previsible que en futuras investigaciones científicas esta tecnología desempeñe un papel más importante en la comprensión de los cambios en la expresión genética y los mecanismos detrás de ellos.
Con una investigación en profundidad sobre la tecnología RT-PCR, ¿cómo cambiará aún más nuestra comprensión de los procesos vitales la aplicación de esta tecnología en biología genética?
