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Génome ou transcriptome ? La différence clé dans le choix de la bonne méthode d'assemblage !
Avec le développement des nouvelles technologies de séquençage, la recherche sur le transcriptome est entrée dans une nouvelle ère. En particulier entre 2008 et 2012, la baisse significative des coûts de séquençage a permis d’assembler et d’analyser les transcriptomes de nombreux organismes non modèles. Ce changement va au-delà de la recherche de variations phénotypiques dans des organismes spécifiques, nous permettant de mieux comprendre la diversité et les mécanismes biologiques de la vie sur Terre.
« Le plus grand avantage de l’assemblage du transcriptome est sa capacité à révéler de nouvelles protéines et leurs isoformes qui peuvent jouer un rôle clé dans des phénomènes biologiques spécifiques. »
Il existe deux méthodes principales pour l'assemblage du transcriptome : l'assemblage de novo et l'assemblage basé sur les références. Pour les organismes non modèles pour lesquels un génome complet n’a pas encore été établi, l’assemblage de novo du transcriptome est évidemment un choix plus approprié. Cette approche ne s’appuie pas sur des séquences génomiques antérieures, ce qui permet aux chercheurs d’explorer des informations de transcription génétique inconnues.
Assemblage de novo vs. assemblage basé sur les références
Dans le passé, l’analyse des données du transcriptome reposait principalement sur la comparaison avec des génomes de référence existants. Cependant, cette approche peut ne pas couvrir toutes les variations structurelles de l’ARNm, en particulier lorsque l’épissage alternatif est impliqué, et de nombreuses variantes de transcription peuvent être manquées car elles ne peuvent pas être cartographiées de manière discontinue sur le génome. Par conséquent, même avec un génome de référence, il est toujours nécessaire d'effectuer un assemblage de novo, car le nouvel assemblage peut récupérer les transcrits manquants dans le génome de référence.
Transcriptome et assemblage du génome
La profondeur de couverture du transcriptome peut refléter directement le niveau d’expression du gène, tandis que la profondeur de couverture du génome est généralement affectée par des séquences répétitives. De plus, l’un des plus grands défis auxquels est confronté l’assemblage du transcriptome est que différentes variantes de transcription dans le même gène peuvent partager des exons, ce qui rend leur identification plus compliquée.
Méthodes d'assemblage du transcriptome
ARN-seqAprès l’extraction et la purification de l’ARN, les échantillons seront envoyés vers une installation de séquençage à haut débit pour une transcription inverse afin d’obtenir une bibliothèque d’ADNc. Selon la plateforme, ces ADNc seront coupés en longueurs spécifiques puis séquencés à l'aide de différentes technologies, notamment le séquençage 454, Illumina et SOLiD.
Algorithme d'assemblage
Les données de séquence des transcriptions seront assemblées en transcriptions à l'aide d'un programme d'assemblage de transcriptions à lecture courte. Étant donné que les transcriptions peuvent être similaires mais présenter des variations au niveau des acides aminés, ces variations peuvent refléter différentes isoformes de protéines. Plusieurs programmes d’assemblage peuvent être utilisés pour réaliser ce processus, mais l’assemblage du transcriptome présente de nombreux défis uniques.
« La plupart des assembleurs à lecture courte suivent deux algorithmes de base : le graphe de chevauchement et le graphe de Bruijn, le graphe de Bruijn étant préféré en raison de ses exigences de calcul relativement faibles. »
Notes fonctionnelles
L’annotation fonctionnelle des transcriptions assemblées peut fournir une compréhension approfondie de leurs fonctions biologiques potentielles. À l’aide d’outils tels que Blast2GO, des données de séquences non annotées peuvent être exploitées sur la base de l’ontologie génétique. Ce processus peut aider à identifier les processus biologiques dans lesquels les transcriptions sont impliquées et leurs fonctions moléculaires.
Validation et contrôle qualité
Comme il est rare de disposer d’un bon génome de référence, la qualité de la séquence assemblée doit être vérifiée en la comparant aux lectures brutes. Le filtrage des séquences courtes est également nécessaire car ces séquences courtes ne peuvent généralement pas se replier efficacement en protéines fonctionnelles.
Choisir un assembleur
Il existe de nombreux logiciels d'assemblage disponibles sur le marché qui peuvent être utilisés pour générer des transcriptomes. Par exemple, des outils tels que SOAPdenovo-Trans et Trinity ont leurs propres caractéristiques uniques. Ces programmes peuvent non seulement assembler efficacement des transcriptions, mais aussi prendre en compte différents événements d'épissage et niveaux d'expression génétique.
Dans ce domaine en évolution rapide, le choix de la méthode d’assemblage du génome ou du transcriptome dépend en fin de compte des besoins du chercheur et des caractéristiques de l’organisme étudié. Chaque méthode présente ses avantages et ses inconvénients. Les chercheurs ont-ils choisi la voie de recherche la mieux adaptée à leurs besoins ?
