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Les secrets de la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse : comment révéler l'expression des gènes grâce à l'ARN ?
La réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse (RT-PCR) est une technique de laboratoire qui combine la transcription de l'ARN en ADN (appelé dans ce contexte ADN complémentaire ou ADNc) et l'amplification d'une cible ADN spécifique. Ce processus utilise la réaction en chaîne par polymérase réaction (PCR). Cette technique est principalement utilisée pour mesurer la quantité d'ARN spécifique en surveillant la fluorescence de la réaction d'amplification, appelée PCR en temps réel ou PCR quantitative (qPCR). Dans la littérature scientifique, la RT-PCR est parfois utilisée de manière confuse par certains auteurs pour désigner la PCR en temps réel. Dans cet article, nous faisons spécifiquement référence à la RT-PCR sous le nom de PCR de transcription inverse.
En raison de sa simplicité, de sa grande spécificité et de sa sensibilité, la RT-PCR a été utilisée dans une grande variété d’expériences, allant de la quantification des cellules de levure dans le vin à la détection d’agents pathogènes infectieux.
Principes et applications de la RT-PCR
Le principe de la RT-PCR consiste d'abord à convertir le modèle d'ARN en ADNc, qui est ensuite amplifié de manière exponentielle par PCR. Ce changement révolutionnaire dans le processus nous permet de détecter les transcriptions de presque tous les gènes et d’amplifier les échantillons, éliminant ainsi les grandes quantités de matériel de départ nécessaires lors de l’utilisation du Northern blotting.
La RT-PCR est devenue l’une des techniques les plus importantes, de l’analyse de l’expression génétique au diagnostic des agents pathogènes infectieux. Par exemple, les scientifiques étudient comment utiliser la RT-PCR pour tester le cancer afin d’améliorer le pronostic et de surveiller la réponse au traitement.
Par exemple, les cellules tumorales circulantes produisent des transcrits d’ARNm uniques en fonction du type de cancer, et la RT-PCR peut analyser les niveaux d’expression de ces transcrits.
Évolution technique de la RT-PCR
Depuis la première introduction du Northern blotting en 1977, bien que la technique présente ses inconvénients dans la quantification de l'ARN, comme le fait qu'elle prend du temps et nécessite de grandes quantités d'ARN, la RT-PCR est devenue une méthode populaire pour la détection et la quantification de l'ARN depuis l'invention de PCR par Kary Mullis en 1983. La méthode de choix pour la quantification. Ce processus non seulement ne nécessite aucun post-traitement, mais peut également mesurer l’abondance de l’ARN plus de 107 fois, fournissant ainsi des données de qualité et de quantité.Actuellement, la technologie RT-PCR a développé différents modes de fonctionnement : une étape et deux étapes. La RT-PCR en deux étapes nécessite que la transcription inverse et l'amplification PCR soient effectuées dans des tubes à essai différents, tandis que la RT-PCR en une seule étape peut être réalisée dans un seul tube à essai. Bien que la méthode à guichet unique soit plus pratique pour une détection rapide, elle est susceptible de dégrader l'échantillon lorsque des tests répétés sont effectués.
Défis et orientations futures de la RT-PCR
Bien que la technologie RT-PCR présente de nombreux avantages, elle est encore confrontée à certains défis. Par exemple, au cours de plusieurs cycles de PCR, la croissance exponentielle de l’ADN complémentaire (ADNc) après la transcription inverse produit une quantification inexacte du point final, tandis que la qRT-PCR surmonte ce problème grâce à l’ajout de la technologie de surveillance de la fluorescence. De plus, la sensibilité élevée signifie que même des traces de contamination de l’ADN peuvent fausser les résultats. Il est donc essentiel de planifier et de concevoir des sources de variation dans la technologie.
Par exemple, l’ajout d’une quantité connue d’ARN comme échantillon de référence peut aider les chercheurs à effectuer des contrôles et des analyses quantitatifs.
Avec l’évolution continue de la technologie, la RT-PCR a un large potentiel d’application dans le diagnostic génétique, la détection du cancer et le dépistage précoce des maladies. On peut prévoir que dans la recherche scientifique future, cette technologie jouera un rôle plus important dans la compréhension des changements dans l’expression des gènes et des mécanismes qui les sous-tendent.
Avec l’étude approfondie de la technologie RT-PCR, comment l’application de cette technologie en biologie génétique va-t-elle modifier davantage notre compréhension des processus de la vie ?
