Language
Country/Area
No result found
ngkap misteri antara perakitan genom dan transkriptom dan pelajari mengapa perakitan transkriptom terkadang merupakan pilihan terbaik
Dengan pengembangan teknologi sekuensing baru, biaya sekuensing turun drastis dari tahun 2008 hingga 2012, menjadikan perakitan transkriptom sebagai pilihan ideal untuk penelitian. Di masa lalu, biaya sekuensing genom mencegah banyak organisme nonmodel mendapatkan perhatian yang cukup, tetapi ini semua telah berubah dengan diperkenalkannya teknologi sekuensing berthroughput tinggi (yaitu, teknologi sekuensing generasi berikutnya). Pengembangan teknologi ini tidak hanya mengurangi biaya tetapi juga meningkatkan efisiensi kerja, memungkinkan perluasan objek penelitian ke rentang organisme nonmodel yang lebih luas. Misalnya, transkriptom otak buncis, cacing pipih, kepiting biru Hawaii, dan buaya Nil, ular jagung, naga berjanggut, dan slider bertelinga merah telah dirakit dan dianalisis.
Meneliti organisme nonmodel dapat memberikan wawasan baru tentang mekanisme "inovasi morfologi yang menarik" yang memungkinkan kehidupan di Bumi berkembang pesat.
Dalam kerajaan tumbuhan dan hewan, banyak "inovasi" seperti mimikri, simbiosis, parasitisme, dan reproduksi aseksual tidak dapat diuji pada organisme model umum. Karena perakitan transkriptom umumnya lebih murah dan lebih sederhana daripada genom, pendekatan ini sering kali menjadi pilihan terbaik untuk mempelajari organisme nonmodel. Transkriptom organisme ini dapat mengungkap protein baru dan bentuk variannya yang terkait dengan fenomena biologis unik ini.
Perbandingan perakitan transkriptom dan genomSeperangkat transkrip yang dirakit sangat penting untuk studi ekspresi gen awal. Sebelum pengembangan program komputasi untuk perakitan transkriptom, data transkriptom terutama dianalisis dengan memetakan ke genom referensi. Meskipun penyelarasan genom merupakan metode yang kuat untuk mengkarakterisasi urutan yang ditranskripsi, metode ini memiliki keterbatasan karena tidak dapat memperhitungkan perubahan struktural dalam transkrip mRNA, seperti penyambungan alternatif. Karena genom mengandung semua intron dan ekson yang mungkin muncul dalam transkrip, varian sambatan dengan penyelarasan terputus-putus mungkin diabaikan sebagai varian protein yang sebenarnya. Bahkan jika genom referensi tersedia, perakitan de novo harus dilakukan karena memungkinkan pemulihan transkrip dari fragmen yang hilang dari genom induk.
Perbedaan antara transkriptom dan perakitan genom
Tidak seperti tingkat cakupan urutan genom, yang bervariasi secara acak dengan konten berulang dalam DNA non-pengodean, tingkat cakupan urutan transkriptom dapat secara langsung mencerminkan tingkat ekspresi gen. Urutan berulang ini juga menciptakan ambiguitas dalam perakitan genom, sementara ambiguitas dalam perakitan transkriptom sering kali berhubungan dengan varian sambatan atau perubahan kecil antara anggota keluarga gen. Ada beberapa alasan mengapa perakit genom tidak dapat digunakan secara langsung untuk perakitan transkriptom. Pertama, kedalaman pengurutan genom biasanya konsisten di seluruh genom, tetapi kedalaman transkrip dapat bervariasi. Kedua, kedua untai dalam gPengurutan enom selalu diurutkan, sedangkan RNA-seq dapat bersifat spesifik untai. Pada akhirnya, perakitan transkrip lebih menantang karena varian transkrip dari gen yang sama dapat berbagi ekson dan sulit untuk dipisahkan dengan jelas.Metodologi
RNA-seqSetelah RNA diekstraksi dan dimurnikan dari sel, RNA dikirim ke fasilitas pengurutan berthroughput tinggi tempat RNA pertama kali ditranskripsi balik untuk membuat pustaka cDNA. CDNA ini kemudian dapat difragmentasi menjadi berbagai panjang tergantung pada platform pengurutan yang digunakan. Berbagai platform berikut menggunakan berbagai jenis teknologi untuk mengurutkan jutaan bacaan pendek, termasuk pengurutan 454, Illumina, dan SOLiD.
Algoritma Perakitan
Bacaan urutan cDNA yang dihasilkan di atas akan dirakit menjadi transkrip melalui program perakitan transkrip bacaan pendek. Sering kali beberapa variasi asam amino dapat dideteksi, yang mungkin mencerminkan varian protein yang berbeda atau mungkin mewakili gen yang berbeda dalam keluarga gen yang sama atau bahkan gen yang hanya berbagi domain yang dilestarikan. Sementara program-program ini umumnya berhasil dalam merakit genom, mereka menghadapi tantangan unik dalam perakitan transkriptom. Tidak seperti cakupan urutan tinggi untuk genom, untuk transkriptom, cakupan urutan tinggi mungkin menyiratkan urutan yang melimpah daripada berulang. Selain itu, pengurutan transkriptom dapat bersifat khusus untai, dalam hal ini transkrip sense dan antisense hadir. Pada akhirnya, merekonstruksi dan membedah semua varian sambatan mungkin terbukti sulit.
Catatan Fungsional
Anotasi fungsional dari transkrip yang dirakit memberikan wawasan tentang fungsi molekuler tertentu dari protein putatif, komponen seluler, dan proses biologis. Blast2GO (B2G) dapat membuat anotasi data urutan yang belum memiliki anotasi GO dengan menyelaraskan fragmen kontig yang dirakit dengan basis data protein non-redundan NCBI. Ini adalah alat yang sering digunakan dalam studi genomik fungsional spesies nonmodel.
Validasi dan kontrol kualitas
Karena genom referensi yang baik jarang tersedia, kualitas perakitan komputasional dapat divalidasi dengan membandingkan urutan yang dirakit dengan pembacaan yang digunakan untuk menghasilkannya (tanpa referensi) atau dengan menyelaraskan urutan domain gen yang dilestarikan dengan transkriptom atau genom spesies yang berkerabat dekat (berdasarkan referensi). Alat seperti Transrate dan DETONATE melakukan analisis statistik melalui metode ini untuk menilai kualitas perakitan.
Dalam bidang penelitian genomik yang berkembang pesat ini, perakitan transkriptom tidak diragukan lagi merupakan salah satu alat inti untuk memahami keanekaragaman hayati. Dengan keanekaragaman hayati yang begitu kaya, bagaimana kita dapat menerapkan temuan ini pada upaya bioteknologi dan konservasi di masa mendatang?
