Language
Country/Area
No result found
Rahasia reaksi berantai polimerase transkripsi terbalik: Bagaimana mengungkap ekspresi gen melalui RNA?
Reaksi berantai polimerase transkripsi terbalik (RT-PCR) adalah teknik laboratorium yang menggabungkan transkripsi RNA menjadi DNA (dalam konteks ini disebut DNA komplementer atau cDNA) dan amplifikasi target DNA tertentu. Proses ini menggunakan reaksi berantai polimerase (PCR). Teknik ini terutama digunakan untuk mengukur jumlah RNA tertentu dengan memantau fluoresensi reaksi amplifikasi, yang disebut PCR waktu nyata atau PCR kuantitatif (qPCR). Dalam literatur ilmiah, RT-PCR terkadang digunakan secara membingungkan oleh beberapa penulis untuk merujuk pada PCR waktu nyata. Dalam artikel ini, kami merujuk RT-PCR secara khusus sebagai PCR transkripsi terbalik.
Karena kesederhanaannya, spesifisitasnya yang tinggi, dan sensitivitasnya, RT-PCR telah digunakan dalam berbagai macam eksperimen, mulai dari mengukur sel ragi dalam anggur hingga mendeteksi patogen infeksius.
Prinsip dan Aplikasi RT-PCR
Prinsip RT-PCR adalah pertama-tama mengubah cetakan RNA menjadi cDNA, yang kemudian diperbanyak secara eksponensial menggunakan PCR. Perubahan revolusioner dalam proses ini memungkinkan kita untuk mendeteksi transkrip dari hampir semua gen dan memperbanyak sampel, sehingga menghilangkan sejumlah besar bahan awal yang diperlukan saat menggunakan Northern blotting.
RT-PCR telah menjadi salah satu teknik terpenting dari analisis ekspresi gen hingga diagnosis patogen infeksius. Misalnya, para ilmuwan sedang mempelajari cara menggunakan RT-PCR untuk pengujian kanker guna meningkatkan prognosis dan memantau respons pengobatan.
Misalnya, sel tumor yang bersirkulasi menghasilkan transkrip mRNA yang unik tergantung pada jenis kankernya, dan RT-PCR dapat menganalisis tingkat ekspresi transkrip ini.
Evolusi teknis RT-PCR
Sejak Northern blotting pertama kali diperkenalkan pada tahun 1977, meskipun teknik ini memiliki kekurangan dalam kuantifikasi RNA, seperti memakan waktu dan membutuhkan RNA dalam jumlah besar, RT-PCR telah menjadi metode populer untuk deteksi dan kuantifikasi RNA sejak penemuan PCR oleh Kary Mullis pada tahun 1983. Metode pilihan untuk kuantisasi. Proses ini tidak hanya tidak memerlukan pasca-pemrosesan, tetapi juga dapat mengukur kelimpahan RNA lebih dari 107 kali, yang selanjutnya menyediakan data kualitas dan kuantitas.Saat ini, teknologi RT-PCR telah mengembangkan berbagai mode operasi: satu tahap dan dua tahap. RT-PCR dua tahap memerlukan transkripsi balik dan amplifikasi PCR untuk dilakukan dalam tabung reaksi yang berbeda, sedangkan RT-PCR satu tahap dapat diselesaikan dalam satu tabung reaksi. Meskipun metode satu tahap lebih nyaman untuk deteksi cepat, metode ini rentan terhadap degradasi sampel saat pengujian berulang kali dilakukan.
Tantangan dan arah masa depan RT-PCR
Meskipun teknologi RT-PCR memiliki banyak keunggulan, teknologi ini masih menghadapi beberapa tantangan. Misalnya, selama beberapa siklus PCR, pertumbuhan eksponensial DNA komplementer (cDNA) setelah transkripsi balik menghasilkan kuantifikasi titik akhir yang tidak akurat, sementara qRT-PCR mengatasi masalah ini karena penambahan teknologi pemantauan fluoresensi. Selain itu, sensitivitas yang tinggi berarti bahwa bahkan sejumlah kecil kontaminasi DNA dapat mendistorsi hasil. Oleh karena itu, sangat penting untuk merencanakan dan merancang sumber variasi dalam teknologi.
Misalnya, menambahkan sejumlah RNA yang diketahui sebagai sampel referensi dapat membantu peneliti melakukan kontrol dan analisis kuantitatif.
Dengan evolusi teknologi yang berkelanjutan, RT-PCR memiliki potensi aplikasi yang luas dalam diagnosis genetik, deteksi kanker, dan skrining penyakit dini. Dapat diramalkan bahwa dalam penelitian ilmiah di masa depan, teknologi ini akan memainkan peran yang lebih penting dalam memahami perubahan dalam ekspresi gen dan mekanisme di baliknya.
Dengan studi mendalam tentang teknologi RT-PCR, bagaimana penerapan teknologi ini dalam biologi genetika akan semakin mengubah pemahaman kita tentang proses kehidupan?
