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Dettagli nascosti dell'inibizione competitiva: cosa ci dicono i grafici di Lineweaver-Burk?
In biochimica, un grafico di Lineweaver-Burk (o grafico reciproco doppio) è una rappresentazione grafica dell'equazione di Michaelis-Menten per la cinetica enzimatica, descritta per la prima volta da Hans Lineweaver e Dean Burk nel 1934. Sebbene questo grafico sia stato storicamente ampiamente utilizzato per valutare i parametri cinetici degli enzimi, presenta una struttura di errore distorta nei suoi dati e non è uno strumento ottimale per determinare i parametri cinetici degli enzimi. Attualmente, i metodi che utilizzano la regressione non lineare sono più accurati e sono diventati più accessibili con la diffusione dei computer desktop.
Definizione del diagramma Lineweaver-Burk
Il grafico di Lineweaver-Burk è derivato da una trasformazione dell'equazione di Michaelis-Menten. Questa equazione esprime la relazione tra la velocità dell'enzima v e la concentrazione del substrato a, coinvolgendo due parametri: V (velocità limite) e Km (costante di Michaelis). Calcolando il reciproco di entrambi i lati di questa equazione, il risultato forma una linea retta. L'intercetta verticale di questa retta è 1/V, l'intercetta orizzontale è -1/Km e la pendenza è Km/V.
Applicazioni
Quando viene utilizzato per determinare il tipo di inibizione enzimatica, il grafico di Lineweaver-Burk può distinguere tra inibitori competitivi, puramente non competitivi e non competitivi. Le diverse modalità di inibizione possono essere contrapposte alle risposte non inibite.
L'inibizione competitiva non influirà sul valore apparente di V, ma aumenterà il valore apparente di Km e ridurrà l'affinità del substrato.
Inibizione competitiva
La caratteristica dell'inibizione competitiva è che l'inibitore compete con il substrato per il sito di legame dell'enzima. Pertanto, in questo caso, il valore apparente di V non verrà influenzato, ma aumenterà il Km, il che significa che l'affinità tra l'enzima e il substrato diminuirà. Come si può vedere nella figura, il valore dell'intercetta per l'enzima inibito è maggiore di quello per l'enzima non inibito.
Inibizione pura non competitiva
Nella pura inibizione non competitiva, il valore apparente di V diminuirà, mentre Km non verrà influenzato. Nel grafico Lineweaver-Burk, ciò si riflette come un aumento dell'intercetta verticale, ma un'intercetta orizzontale costante, indicando che l'affinità del substrato non è influenzata.
Inibizione mista
L'inibizione pura non competitiva è in realtà molto rara, mentre l'inibizione mista è molto più comune. In caso di inibizione mista, il valore apparente di V diminuirà, mentre il valore di Km generalmente aumenterà, indicando che l'affinità del substrato generalmente diminuirà. Molti studiosi concordano con Cleland a questo proposito, riconoscendo l'influenza dell'inibizione mista.
Inibizione non competitiva
In caso di inibizione non competitiva, il valore apparente di V diminuirà, mentre il valore di Km non cambierà. Ciò si riflette nella figura come un aumento dell'intercetta verticale ma una pendenza invariata. L'affinità del substrato aumenterà invece e il valore apparente di Km diminuirà.
Carenze
I grafici Lineweaver-Burk sono poco efficaci nel visualizzare l'errore sperimentale. In particolare, se l'errore nel tasso v ha un errore standard uniforme, allora l'errore in 1/v sarà molto ampio. Lineweaver e Burk erano consapevoli di questo problema e hanno studiato sperimentalmente la distribuzione degli errori, decidendo infine di utilizzare una ponderazione appropriata per l'adattamento. Tuttavia, questo aspetto è quasi universalmente ignorato da coloro che citano "l'approccio di Lineweaver e Burk".
ConclusioneI grafici di Lineweaver-Burk forniscono un metodo efficace per analizzare la cinetica enzimatica in biochimica, ma i loro limiti non possono essere ignorati. Nell'attuale contesto tecnologico, il metodo di regressione non lineare corretto dimostra la sua superiorità. Con il progredire della ricerca biochimica, questi strumenti troveranno applicazioni più precise?
