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Vedere i processi dinamici all'interno delle cellule: in che modo l'imaging a fluorescenza può aiutarci a comprendere l'espressione genetica?
L'imaging a fluorescenza è una tecnologia di imaging non invasiva che ci aiuta a visualizzare i processi biologici che si verificano negli organismi viventi. Questa tecnica utilizza una varietà di metodi tra cui microscopia, sonde per immagini e tecniche spettroscopiche per generare immagini. La fluorescenza è essenzialmente un fenomeno di luminescenza che si verifica quando una sostanza assorbe la radiazione elettromagnetica ed emette luce di una lunghezza d'onda specifica. Le molecole che emettono luce sono chiamate fluorofori. L'imaging a fluorescenza utilizza coloranti fluorescenti e proteine fluorescenti per etichettare meccanismi e strutture molecolari, consentendo l'osservazione sperimentale dei processi dinamici di espressione genica, espressione proteica e interazioni molecolari.
L'imaging a fluorescenza fornisce uno strumento quantitativo preciso per applicazioni biochimiche.
In generale, esiste un malinteso tra fluorescenza e bioluminescenza. La differenza tra i due risiede nei processi proteici che producono la luce. La bioluminescenza è un processo chimico che coinvolge gli enzimi che scompongono un substrato per produrre luce, mentre la fluorescenza è l'eccitazione fisica degli elettroni e il loro successivo ritorno allo stato fondamentale per rilasciare luce.
Meccanismo di fluorescenza
Quando una molecola assorbe la luce, l'energia della molecola sale brevemente a uno stato eccitato più elevato. Al successivo ritorno allo stato fondamentale viene emessa luce fluorescente, che può essere rilevata e misurata. La lunghezza d'onda specifica della luce emessa è determinata dall'energia fotonica assorbita, pertanto questa lunghezza d'onda deve essere nota in anticipo durante l'esperimento affinché l'apparecchiatura di misurazione possa rilevare correttamente la generazione della luce.
La formula per determinare la lunghezza d'onda dell'emissione di fluorescenza è: λ emissione = hc / Emissione di energia
Qui h è la costante di Planck e c è la velocità della luce. In genere viene utilizzato un grande dispositivo di scansione o CCD per misurare l'intensità e visualizzarla digitalmente.
Coloranti e proteine fluorescenti
I coloranti fluorescenti hanno fotostabilità e luminosità più elevate e non richiedono tempi di maturazione rispetto alle proteine fluorescenti. In termini di luminosità, il coefficiente di estinzione di un fluoroforo (capacità di assorbire la luce) e l'efficienza quantistica (quanto efficacemente converte la luce assorbita in fluorescenza) sono strettamente correlati. Il colorante in sé non è molto fluorescente, ma quando è legato a una proteina diventa più facile da rilevare. Ad esempio, NanoOrange può legarsi alle regioni rivestite e idrofobiche delle proteine e non viene influenzato dagli agenti riducenti.
Le proteine autofluorescono quando assorbono specifiche lunghezze d'onda della luce incidente. Ad esempio, la proteina fluorescente verde (GFP) emette luce verde quando esposta a una luce che va dal blu all’ultravioletto. Le proteine fluorescenti sono eccellenti molecole reporter che aiutano a localizzare le proteine, osservare il legame proteico e quantificare l'espressione genica.
Intervallo immagini
Poiché alcune lunghezze d'onda fluorescenti sono oltre la portata dell'occhio umano, i CCD vengono utilizzati per rilevare con precisione la luce e visualizzarne l'immagine. Questo viene tipicamente fatto nell'intervallo 300-800 nm. Un vantaggio dei segnali di fluorescenza è che la relazione tra l'intensità della luce emessa e il numero di molecole fluorescenti fornite è generalmente lineare, richiedendo essenzialmente che l'intensità della luce incidente e la lunghezza d'onda rimangano costanti. L'immagine finale viene solitamente renderizzata in formato dati a 12 o 16 bit.
Sistema di imaging
I componenti principali di un sistema di imaging a fluorescenza includono: sorgente di eccitazione (che può produrre luce o laser ad ampia lunghezza d'onda), ottica di visualizzazione della luce (utilizzata per illuminare il campione), ottica di raccolta della luce (solitamente composta da lenti, specchi e filtri ), nonché dispositivi di rilevamento, amplificazione e visualizzazione (come tubi fotomoltiplicatori o CCD).
Applicazione
La tecnologia di imaging a fluorescenza è stata ampiamente utilizzata in diversi campi scientifici, tra cui:
- Nella PCR (elettroforesi su gel di agarosio), SYBR Green è un colorante comune utilizzato per visualizzare le bande di DNA.
- Utilizzo dell'imaging a fluorescenza per facilitare la navigazione durante il trapianto. Ad esempio, l’alzavola indiana può essere utilizzata nei pazienti affetti da cancro per rilevare i linfonodi.
- Nell'imaging del calcio, le molecole fluorescenti vengono utilizzate per monitorare l'attività delle cellule viventi nel sistema nervoso.
Vantaggi e svantaggi
Sebbene l'imaging a fluorescenza presenti alcuni vantaggi, come il funzionamento non invasivo e l'elevata sensibilità, esistono anche alcune sfide, come lo sbiancamento della fluorescenza, la sensibilità ambientale e le limitazioni nel potere risolutivo.
Direzione futura
Gli scienziati stanno lavorando per sviluppare proteine fluorescenti più efficienti per migliorare le prestazioni delle sonde per l'imaging. Attraverso metodi quali l'ingegneria genetica e la stabilizzazione ambientale, si prevede che la futura tecnologia di imaging a fluorescenza raggiungerà progressi in molteplici dimensioni.
L'imaging a fluorescenza offre un'ampia gamma di opportunità per esplorare le attività all'interno delle cellule, quindi quali nuovi fenomeni biologici potrebbero rivelare le scoperte future?
