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La magia dei frammenti amplificati: come trovare indizi chiave nella ricerca genetica?
In biologia molecolare, un amplicone è un segmento di DNA o RNA prodotto da un evento di amplificazione o replicazione. Questi frammenti possono essere generati artificialmente utilizzando vari metodi, come la reazione a catena della polimerasi (PCR) o la reazione a catena della ligasi (LCR), oppure possono essere il risultato di duplicazioni geniche naturali. L'amplificazione, come qui indicato, include la produzione di copie multiple di un segmento genetico o di una sequenza bersaglio e si riferisce in particolare al segmento amplificato stesso.
L'amplificazione artificiale trova applicazioni nella ricerca, nella medicina legale e in medicina, tra cui il rilevamento e la quantificazione di agenti patogeni infettivi, l'identificazione di resti umani e l'estrazione di genotipi dai capelli umani.
Le duplicazioni genetiche naturali svolgono un ruolo importante nell'evoluzione e sono state collegate a diverse forme di cancro umano, tra cui il linfoma primario del mediastino a cellule B e il linfoma di Hodgkin. Pertanto, in questo contesto, l'amplicone può riferirsi non solo a specifici segmenti di DNA cromosomico, ma anche a segmenti che sono stati escissi, amplificati e reinseriti altrove nel genoma, nonché a segmenti di DNA extracromosomico noti come diminigeni. , ogni frammento può essere composto da uno o più geni.
L'amplificazione dei geni codificati da questi frammenti amplificati solitamente aumenta l'efficienza della trascrizione di questi geni, portando infine a un aumento della quantità di proteine correlate.
Struttura del frammento amplificato
L'amplicone è solitamente una ripetizione diretta (testa-coda) o invertita (testa-testa o coda-coda) di una sequenza genetica e può avere una struttura lineare o circolare. La struttura dell'amplicone circolare è costituita da ripetizioni invertite imperfette che si fondono condizionatamente per formare un cerchio, presumibilmente formato da un amplicone lineare precursore. Quando si amplifica artificialmente, la lunghezza del frammento amplificato dipende dall'obiettivo dell'esperimento.
Progressi nella tecnologia di amplificazione
L'analisi dei frammenti amplificati è stata resa possibile grazie allo sviluppo di metodi di amplificazione come la PCR, e sono emerse sempre più tecnologie di sequenziamento del DNA di alta qualità e ad alto rendimento, come la tecnologia di sequenziamento dei semiconduttori ionici, che è spesso denominato Il marchio dello sviluppatore si chiama Ion Torrent. Queste tecnologie di sequenziamento hanno reso possibile lo studio di frammenti di ampliconi nei campi della biologia e della genetica del genoma, tra cui la ricerca sulla genetica del cancro, gli studi filogenetici e la genetica umana. Prendiamo come esempio il gene 16S rRNA. Questo gene fa parte del genoma di ogni batterio e archaea ed è altamente conservato. Confrontando la sequenza del frammento amplificato con la sequenza nota, i batteri possono essere classificati.
Quasi tutti i sequenziamenti di frammenti amplificati richiedono la quantificazione del prodotto amplificato, che solitamente comporta una fase di cattura e una fase di rilevamento, e i metodi di implementazione specifici variano.
Applicazione di frammenti amplificati
La PCR può essere utilizzata per determinare il sesso di un campione di DNA umano. Selezionando il sito di inserimento dell'elemento Alu per l'amplificazione e valutando la dimensione del frammento, il test di genere utilizza AluSTXa per corrispondere al cromosoma X e AluSTYa per corrispondere al cromosoma Y. Questo design può ridurre efficacemente la possibilità di errore. Quando la regione omologa viene amplificata, il cromosoma inserito produrrà frammenti più grandi. I maschi possono essere distinti in quanto hanno due frammenti di amplificazione del DNA, mentre le femmine ne hanno solo uno. Il pacchetto di metodi per questo metodo include una coppia di primer per i siti di amplificazione e reagenti selettivi per la reazione a catena della polimerasi. Nella diagnosi della tubercolosi, la LCR è stata utilizzata anche come test, con la sequenza bersaglio contenente l'antigene proteico B presa di mira da quattro primer oligonucleotidici rispettivamente per il filamento senso e quello inverso.
I prodotti o frammenti amplificati vengono valutati attraverso varie fasi di rilevamento e cattura. Con lo sviluppo del sequenziamento degli ampliconi, i vari frammenti di ampliconi generati da un campione comune vengono collegati e sequenziati, seguiti dalla classificazione del controllo di qualità e infine viene calcolato il numero dello stesso tipo per riflettere la loro abbondanza relativa nel campione. Ricchezza.
Con il progresso della tecnologia, i frammenti amplificati sono diventati una parte indispensabile della ricerca genetica odierna. Ma in questo campo in rapida evoluzione, comprendiamo appieno il potenziale dei frammenti amplificati?
