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La magica chimica del metodo Bradford: come scoprire il segreto delle proteine con una goccia di colorante?
Dal suo sviluppo da parte di Marion M. Bradford nel 1976, il dosaggio delle proteine Bradford è diventato uno strumento indispensabile nella ricerca biochimica. Questo metodo di analisi spettroscopica veloce e accurato misura la concentrazione di proteine in soluzione ed è noto per le sue proprietà che dipendono dalla sua composizione aminoacidica. Il metodo Bradford non solo è semplice e facile da eseguire, ma ha anche un'elevata sensibilità, il che rende questo metodo sempre più ampiamente utilizzato nei laboratori.
Il metodo Bradford si basa sulla misurazione dei cambiamenti di colore nei coloranti ftalocianina ed è una misurazione quantitativa osservando l'interazione tra diverse proteine e coloranti.
Principio
Il metodo Bradford è un metodo colorimetrico di misurazione delle proteine basato sulle variazioni di assorbanza del colorante Phthalocyanine Blue G-250. Il colorante è disponibile in tre forme: anionico (blu), neutro (verde) e cationico (rosso). In condizioni acide, il colorante rosso diventa blu e si lega alla proteina da misurare. Senza proteine che si legano, la soluzione rimarrà marrone.
Il colorante si lega ai gruppi carbossilici e amminici della proteina attraverso le forze di van der Waals e le interazioni cariche. Durante questo processo, il colorante rosso ftalocianina trasferisce elettroni liberi alle catene laterali ionizzabili della proteina, distruggendo il suo stato nativo ed esponendo tasche idrofile, che consentono al colorante di essere ulteriormente potenziato attraverso le forze di van der Waals e le interazioni ioniche.
Quando il colorante si lega alla proteina, l'assorbanza passa da 465 nm a 595 nm, rendendo la lettura dell'assorbanza a 595 nm un indicatore di concentrazione.
Vantaggi
Il metodo Bradford può evitare l'interferenza di molti altri metodi di rilevamento delle proteine e presenta un'elevata tolleranza a sostanze come il solfato di sodio (SDS), che rende questo metodo applicabile in vari ambienti. Molti campioni potrebbero non essere misurati in modo affidabile nell'intervallo di assorbimento di 280 nm e la regola di Bradford aggiunge semplicemente colorante e misura a 595 nm.
In questo modo è semplice: basta mescolare il campione con il colorante blu di ftalocianina in una provetta e leggere l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 595 nm. Questo metodo è in grado di misurare proteine da 1 a 20 μg ed è molto sensibile. Il processo di test richiede solitamente non più di 30 minuti e può essere eseguito a temperatura ambiente.
La semplicità e la flessibilità del metodo Bradford lo rendono una scelta rapida e affidabile per il rilevamento delle proteine nei laboratori.
Svantaggi
Nonostante i suoi vantaggi, il metodo Bradford ha un intervallo lineare relativamente piccolo e richiede la diluizione prima dell'analisi, il che può portare all'accumulo di errori. Inoltre, quando il campione contiene determinate condizioni di base o elevate concentrazioni di detergenti, potrebbe interferire con i risultati del test. Inoltre, questo metodo potrebbe non essere sufficientemente accurato per alcuni tipi di proteine, come il collagene.
Ciò significa che quando eseguono il test Bradford, gli scienziati devono essere consapevoli della composizione e dei possibili effetti dei reagenti utilizzati per garantire l'accuratezza dei risultati.
Direzione dello sviluppo futuro
Con il progresso della ricerca scientifica, il test delle proteine Bradford continua a evolversi. Una modifica significativa è l'introduzione di una piccola quantità di SDS, che può quadruplicare la risposta del test del collagene. Allo stesso tempo, ciò riduce anche l’assorbanza di altre proteine diverse dal collagene, rendendo i risultati di rilevamento più accurati.
Processo operativo
La procedura operativa standard per il Metodo Bradford è molto semplice. Ad esempio, utilizzare la gammaglobulina plasmatica bovina cruda come standard proteico con parametri di 200-1500 μg/mL. Nelle applicazioni di test, è sufficiente diluire soluzioni standard di diverse concentrazioni, aggiungere il colorante blu di ftalocianina e lasciarlo riposare per 5 minuti per leggere l'assorbanza a 595 nm e tracciare una curva standard per calcolare la concentrazione della proteina sconosciuta.
La preparazione e l'utilizzo di curve standard rendono il metodo Bradford efficiente e accurato nel calcolo della concentrazione proteica.
Il test delle proteine Bradford è emerso nel campo della ricerca scientifica grazie alle sue proprietà uniche e convenienti. Poiché la domanda di analisi ambientali e di campioni aumenterà in futuro, l'applicabilità e l'importanza di questo metodo aumenteranno ulteriormente. In questo mondo scientifico in rapida evoluzione, possiamo ancora trovare modi più semplici ed efficaci per rivelare i misteri della vita?
