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Il passato del sequenziamento di Sanger e il futuro di NGS: in che modo il sequenziamento del DNA va da singolo a parallelo?
Nel campo della scienza biomedica, la tecnologia di sequenziamento del DNA ha subito cambiamenti significativi.Dall'introduzione del sequenziamento di Sanger, il mistero del genoma è stato svelato per noi e l'emergere del sequenziamento di prossima generazione (NGS) ha spinto questa tecnologia a nuove altezze.Questo salto tecnologico da singolo a parallelo non solo aumenta la velocità del sequenziamento, ma riduce anche il costo del sequenziamento, cambiando così il panorama della ricerca della genomica.
L'emergere di NGS ci consente di ottenere decine di milioni di dati genomici in un breve periodo di tempo, il che è incomparabile al sequenziamento di Sanger.
NGS si riferisce a vari metodi di sequenziamento del DNA ad alto rendimento che utilizzano il concetto di elaborazione parallela su larga scala.Molte di queste tecnologie sono emerse una dopo l'altra dal 1993 al 1998 e sono state commercializzate nel 2005.Queste tecnologie consentono a ciascun strumento di generare letture da 1 milione a 43 miliardi di letture di breve sequenza quando vengono eseguite.In queste piattaforme, le configurazioni tecniche e la chimica del sequenziamento differiscono, ma condividono un paradigma tecnico comune: sequenziamento parallelo su larga scala attraverso modelli di DNA spazialmente isolati e clonalmente amplificati o molecole di DNA singoli.
Allo stesso tempo, il sequenziamento di Sanger è anche noto come sequenziamento di prima generazione, che si basa sull'elettroforesi per separare i prodotti finali.Sebbene questo metodo abbia una lunga storia, sembra senza scrupoli di fronte alle attuali esigenze scientifiche.La metodologia NGS ci consente di completare il lavoro di sequenziamento su larga scala contemporaneamente, portando efficienza e accuratezza senza precedenti alla ricerca genetica.
piattaforma NGS
Il processo di sequenziamento del DNA utilizzando piattaforme NGS disponibili in commercio è generalmente diviso in diversi passaggi:
- Le librerie di sequenziamento del DNA sono state generate dall'amplificazione clonale PCR in vitro.
- La sequenza del DNA è determinata dal sequenziamento sintetico in base all'aumento dei nucleotidi sul filamento complementare.
- I modelli di DNA amplificati spazialmente isolati sono sequenziati simultaneamente in modo parallelo su larga scala, senza la necessità di fasi di separazione fisica.
Sebbene questi passaggi siano simili sulla maggior parte delle piattaforme NGS, le strategie di ciascuna piattaforma variano, il che rende ogni tecnologia unica e le aree di applicazione sul mercato.
La reazione di sequenziamento parallelizzata di NGS può generare centinaia di mega a sequenza nucleotidica di gigabit letture in una singola serie di strumenti.Questo cambiamento ha notevolmente aumentato la quantità di dati di sequenza disponibili, con conseguenti cambiamenti fondamentali nei metodi di sequenziamento del genoma della scienza medica.Con l'emergere di tecnologie e strumenti emergenti NGS, il costo del sequenziamento è stato anche significativamente ridotto, avvicinandosi allo standard di soli $ 1.000 per genoma.
Metodo di preparazione del modello
Durante l'esecuzione di reazioni NGS, ci sono due metodi principali per preparare i modelli: modelli di amplificazione da una singola molecola di DNA e un singolo modello di molecola di DNA.
Per i sistemi di imaging che non sono in grado di rilevare un singolo evento fluorescente, il modello di DNA deve essere amplificato.I metodi di amplificazione comuni includono PCR di emulsione, amplificazione dell'anello di rotolamento e amplificazione della fase solida.
lozione pcr
Nel metodo PCR di emulsione, una libreria di DNA viene prima generata dalla frammentazione casuale del DNA genomico, e quindi il frammento di DNA a singolo filamento è collegato alla superficie della particella con il linker. rappresenta un frammento di DNA.Le particelle vengono quindi confezionate in goccioline di emulsione ad olio d'acqua, ognuna delle quali è un microreattore PCR, in cui viene prodotta una copia di modelli di DNA singola amplificata.
amplificazione del ponte
Nell'amplificazione del ponte, i primer in avanti e inversi sono attaccati in modo covalente al substrato della cella di flusso ad alta densità.Dopo aver esposto il reagente enzimaticamente esteso, il modello accoppiato si estende sui primer di superficie, completando alla fine l'amplificazione locale dei polimeri di DNA in milioni di posizioni diverse, diventando un cluster di modelli indipendente.
modello mono-molecolare
La preparazione di modelli a sola molecola è più intuitiva al confronto, che non richiede un passaggio PCR.Generalmente, i modelli mono-molecolari sono fissati su supporto solido e amplificati in diversi modi.Come nel primo approccio, i primer distribuiti spazialmente sono immobilizzati sul supporto solido e i frammenti di DNA scissi casualmente vengono quindi ibridati ai primer immobilizzati.
Metodo di sequenziamento
I metodi di sequenziamento di NGS hanno le proprie caratteristiche, tra cui sequenziamento sintetico, pirosequenziamento e chimica reversibile Terminator.Lo scopo del sequenziamento sintetico è determinare la sequenza del campione rilevando l'aggiunta di nucleotidi della DNA polimerasi.
Probabilmente, dopo aver perso i noiosi passi richiesti per il tradizionale sequenziamento di Sanger, NGS fornisce un paradigma più efficiente per la ricerca genomica.
Man mano che la tecnologia si sviluppa, abbiamo assistito alla transizione del sequenziamento del DNA da un primo metodo a sequenza singola al modello di elaborazione parallela di oggi, che non solo migliora notevolmente l'efficienza, ma porta anche vantaggi senza precedenti nei costi e nel tempo.In quale direzione si svilupperà la futura tecnologia di sequenziamento del DNA?
