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逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の秘密：RNA を通じて遺伝子発現を明らかにする方法
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、RNAからDNA（この文脈では相補DNAまたはcDNAと呼ばれる）への転写と特定のDNAターゲットの増幅を組み合わせた実験技術です。このプロセスでは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用します。反応（PCR）。この技術は主に、増幅反応の蛍光をモニタリングすることで特定の RNA の量を測定するために使用され、リアルタイム PCR または定量的 PCR (qPCR) と呼ばれます。科学文献では、RT-PCR がリアルタイム PCR を指すために一部の著者によって混同されることがあります。この記事では、RT-PCR を特に逆転写 PCR と呼びます。
RT-PCR は、そのシンプルさ、高い特異性、感度により、ワイン中の酵母細胞の定量化から感染性病原体の検出まで、さまざまな実験に使用されてきました。
RT-PCR の原理と応用
RT-PCR の原理は、まず RNA テンプレートを cDNA に変換し、次に PCR を使用して指数関数的に増幅することです。このプロセスの革命的な変化により、ほぼすべての遺伝子の転写産物を検出し、サンプルを増幅できるようになり、ノーザンブロッティングを使用するときに必要な大量の出発材料が不要になりました。
RT-PCR は、遺伝子発現解析から感染性病原体の診断まで、最も重要な技術の 1 つになっています。たとえば、科学者たちは、予後を改善し、治療への反応を監視するために、がん検査に RT-PCR を使用する方法を研究しています。
たとえば、循環腫瘍細胞は癌の種類に応じて固有の mRNA 転写産物を生成し、RT-PCR はこれらの転写産物の発現レベルを分析できます。
RT-PCR の技術的進化
1977年にノーザンブロッティングが初めて導入されて以来、この技術は時間がかかり、大量のRNAを必要とするなどのRNA定量の欠点があったものの、RT-PCRはRNAの検出と定量の一般的な方法になりました。 1983 年に Kary Mullis が考案した PCR。定量化に最適な方法です。このプロセスでは後処理が不要であるだけでなく、RNA の量を 107 回以上測定できるため、品質と量のデータがさらに提供されます。現在、RT-PCR 技術はワンストップとツーステップという異なる操作モードを開発しています。 2 ステップ RT-PCR では、逆転写と PCR 増幅を別々の試験管で実行する必要がありますが、ワンストップ RT-PCR は 1 つの試験管で完了できます。ワンストップ方式は迅速な検出には便利ですが、繰り返しテストを実行するとサンプルが劣化しやすくなります。
RT-PCR の課題と今後の方向性
RT-PCR 技術には多くの利点がありますが、依然としていくつかの課題も残っています。たとえば、PCR の複数サイクルでは、逆転写後の相補 DNA (cDNA) の指数関数的な増加によりエンドポイントの定量化が不正確になりますが、qRT-PCR では蛍光モニタリング技術を追加することでこの問題を克服しています。さらに、感度が高いということは、微量の DNA 汚染でも結果が歪む可能性があることを意味します。したがって、テクノロジーの変動の原因を考慮して計画し、設計することが重要です。
たとえば、既知量の RNA を参照サンプルとして追加すると、研究者は定量的な制御と分析を実行できるようになります。
技術の継続的な進化により、RT-PCR は遺伝子診断、がん検出、病気の早期スクリーニングにおいて幅広い応用可能性を秘めています。将来の科学研究において、この技術は遺伝子発現の変化とその背後にあるメカニズムを理解する上でさらに重要な役割を果たすことが予想されます。
RT-PCR 技術の徹底的な研究により、この技術を遺伝子生物学に応用することで、生命プロセスに対する理解はどのようにさらに変化するのでしょうか?
