Development and application of quantitative proteomics method for S-nitrosylation analysis

Abstract

Reversible post-translationale Cystein-Modifikationen stellen wichtige Faktoren fur Zellsignalisierung und Redox-Homoostase dar. Unter anderem fungiert die S-Nitrosylierung als Redox-Switch in zahlreichen (patho-)physiologischen Vorgangen. Die Erforschung dieser Modifikation auf proteomweiter Ebene sowie im nativen zellularen Kontext bleibt eine Herausforderung, da effiziente Analysemethoden fehlen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neuartige chemo-proteomische Strategie fur die quantitative Analyse von reversibel modifizierten Cysteinen entwickelt, die sich bioorthogonal spaltbare Verbindungsmolekule sowie eine Austauschtechnik zunutze macht (Cys-BOOST). Der direkte Vergleich von Cys-BOOST mit iodoTMT zur Analyse der Cysteinenaus HeLa Zellextrakten zeigte dreifach erhohte Sensitivitat, erheblich hohere Spezifizitat und technische Reproduzierbarkeit von Cys-BOOST. Unter Einsatz von Cys-BOOST zur Analyse von S-Nitrosylierungen in mit S-Nitrosoglutathion behandelten sowie unbehandelten HeLa-Zellextrakten konnte eine Vielzahl von S-nitrosylierten Proteinen (3,632) sowie einmaligenS-Nitrosylierungsstellen (8,304) identifiziert werden. Gestutzt auf quantitative Daten wurden S-Nitrosylierungsmotive von S-Nitrosylierungsstellen mit unterschiedlicher Reaktivitat auf S-Nitrosoglutathion abgeleitet.Diese Motive beweisen die Relevanz von lokaler Hydrophobizitat und Saure-Basen-Katalyse fur S-Nitrosylierung auf proteomweiter Ebene und beleuchten die herausragende Selektivitat von S-NitrosylierungenaufZielproteinen. Die in vitroAnalyse von S-Nitrosylierungen in SH-SY5Y Neuroblastom-Zellen brachte 2,158 spezifische S-Nitrosylierungsstellen auf 1,443 Proteinen im Grundzustand zum Vorschein,sowie signifikant veranderte S-Nitrosylierungsgrade in Proteinen der Neuro(axono)genese, glutamatergischenSynapsentransmission, Cadherin-Bindung, des NADH-Metabolismus und der Proteinfaltung, Translation und DNA-Replikation, als Reaktion auf fruhen nitrosativen Stress. Insgesamt etablieren diese Ergebnisse Cys-BOOST als effiziente Methode zur proteomweiten quantitativen Analyse von S-Nitrosylierungen und weisen darauf hin, dass S-Nitrosylierung zur globalen Reaktion der Proteinfunktion ebenso beitragt wie Phosphorylierung und Ubiquitinierung.