DESENHO DE PRIMERS PARA ANALISE DO POLIMORFISMO DO GENE MITOCONDRIAL MTATP SUBUNIDADE 6 (MTATP6) EM PEIXE-REI

Abstract

The objective of this work was to construct primers aiming at identifying the polymorphism of the mitochondrial ATP6 gene in the different peixerei species of the genus Odontesthes. The construction of the primers was carried out through the assembled contig of a DNA library of the Odontesthes humensis species, against the mitochondrial ATP6 gene of the species Odontesthes sp. The design of the primers was carried out with the aid of the Primer3 program, and it was established that the primers should have a size between 20 and 30 base pairs, annealing temperature between 50°C and 60°C with a maximum difference of 3°C and a concentration of guanine and cytosine between 40% and 60%. The primer pair was shown to be effective in detecting mitochondrial MT-ATP subunit 6 (ATP6) gene polymorphism in different kingfish species of the genus Odontesthes, making it a tool for the analysis of genetic diversity. Palavras-chave: Odontesthes, dna, mitocôndria, piscicultura Introdução O peixe-rei (Odontesthes humensis) habita as águas doces, comum na região Sul do país, Uruguai e Argentina. No estado do Rio Grande do Sul, tem relevância na pesca artesanal e grande aceitação pela população devido a ótima qualidade de sua carne. Além disso, a alta taxa reprodutiva e amplo espectro alimentar sugerem grande potencial para cultivo, mas seus níveis de produção ainda são baixos (Tavares et al., 2014). Neste aspecto, é de grande importância a pesquisa filogenética para o estudo da evolução e caracterização genética da espécie. As mitocôndrias são estruturas celulares de grande interesse neste estudo, pois possui genoma compacto com estrutura e organização simples, é de herança exclusiva materna e presente em organismos em número haplóide, o que impede (ou torna raros) os eventos de recombinação, sendo capaz de diferir populações geográficas com eficiência pela identificação dos haplótipos ou clones de DNA Mitocondrial (mtDNA) (Churikov et al., 2001). O gene mitocondrial (MT)-ATP6 é responsável por fornecer informações para produção da proteína MT-ATP 6, essencial para a função mitocondrial normal, pois forma uma parte de uma enzima chamada ATP sintase. O gene possui uma região codificante que poderia ser facilmente identificada e por apresentar uma baixa taxa de substituição do que a região controle, baseado geralmente em conhecimentos de mtDNA de peixes (Lenaz et al., 2004). O seguinte trabalho teve como objetivo a construção de primers visando a identificação do polimorfismo do gene mitocondrial ATP6 nas diferentes espécies de peixe-rei do gênero Odontesthes. Material e Métodos A construção dos primers foi realizada através da contig montada de uma biblioteca de DNA, da espécie Odontesthes humensis, contra o gene mitocondrial ATP6 da espécie Odontesthes sp. A biblioteca de DNA foi gerada por um sequenciador GAIIx (Illumina) no modo paired-end, obtendo sequências com 150 pares de bases (pb). A montagem por referência foi feita com o programa Bowtie2 e a obtenção da contig com o programa Samtoll. O desenho dos primers foi realizado com o auxílio do programa Primer3, sendo estabelecido que os primers deveriam apresentar um tamanho entre 20 e 30 pares de bases, temperatura de anelamento entre 50°C e 60°C com diferença de no máximo 3°C e concentração de guanina e citosina entre 40% e 60%. Resultados e Discussão A contig gerada pelo alinhamento dos reads do sequenciamento contra o gene referência, foi de 684 pares de base, apresentando 43 sítios de polimorfismo. Helbert et al. (2003) relatam que os estudos de regiões de genes mitocondriais com alto polimorfismo permitem identificar espécies e diagnosticar novas espécies, auxiliando a desvendar a diversidade genética em um ambiente. De acordo com Markoulatos et al. (2002) a validação de uma reação de PCR, principalmente quando se trata de um par de primer, requer planejamento estratégico. Foram construídos cinco pares de primers, sendo selecionado o par que apresentou maior produto (585 pb) da PCR e que amplificou o fragmento que contivesse o maior número de polimorfismo, neste caso 38 polimorfismo de um total de 43 da contig (Figura 1). O par de primer selecionado também apresentou características favoráveis para a amplificação do gene mitocondrial ATP6 nas espécies de peixe-rei: Odontesthes humensis, Odontesthes bonariensis e Odontesthes sp. Figura 1Par de primer selecionado. Conclusão O par de primer desenhado demostrou-se eficaz para detectar o polimorfismo do gene mitocondrial MT-ATP subunidade 6 (ATP6) em diferentes espécies de peixerei do gênero Odontesthes, tornando uma ferramenta para análise da diversidade genética.