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Genoma ou transcriptoma? A principal diferença na escolha do método de montagem correto!
Com o desenvolvimento de tecnologias emergentes de sequenciamento, a pesquisa do transcriptoma entrou em uma nova era. Especialmente entre 2008 e 2012, o declínio significativo nos custos de sequenciamento tornou possível montar e analisar transcriptomas de muitos organismos não modelo. Essa mudança vai além de encontrar variações fenotípicas em organismos específicos, permitindo-nos entender mais completamente a diversidade e os mecanismos biológicos da vida na Terra.
"O maior benefício da montagem do transcriptoma é seu potencial para revelar novas proteínas e suas isoformas que podem desempenhar papéis importantes em fenômenos biológicos específicos."
Existem dois métodos principais para a montagem do transcriptoma: montagem de novo e montagem baseada em referência. Para organismos não modelo para os quais um genoma completo ainda não foi estabelecido, a montagem do transcriptoma de novo é obviamente uma escolha mais apropriada. Essa abordagem não depende de sequências genômicas anteriores, permitindo que os pesquisadores explorem informações desconhecidas de transcrição genética.
Montagem de novo vs. baseada em referência
No passado, a análise de dados do transcriptoma dependia principalmente da comparação com genomas de referência existentes. Entretanto, essa abordagem pode não cobrir todas as variações estruturais do mRNA, especialmente quando o splicing alternativo está envolvido, e muitas variantes de transcrição podem ser perdidas porque não podem ser mapeadas descontinuamente no genoma. Portanto, mesmo com um genoma de referência, ainda é necessário realizar uma montagem de novo, pois a nova montagem pode recuperar transcrições que estão faltando no genoma de referência.
Transcriptoma e montagem do genoma
A profundidade de cobertura do transcriptoma pode refletir diretamente o nível de expressão do gene, enquanto a profundidade de cobertura do genoma é geralmente afetada por sequências repetitivas. Além disso, um dos maiores desafios enfrentados pela montagem do transcriptoma é que diferentes variantes de transcrição no mesmo gene podem compartilhar éxons, o que torna sua identificação mais complicada.
Métodos para montagem do transcriptoma
RNA-sequenciamentoApós a extração e purificação do RNA, as amostras serão enviadas para uma instalação de sequenciamento de alto rendimento para transcrição reversa para obter uma biblioteca de cDNA. Dependendo da plataforma, esses cDNAs serão cortados em comprimentos específicos e então sequenciados usando diferentes tecnologias, incluindo sequenciamento 454, Illumina e SOLiD.
Algoritmo de montagem
Os dados de sequência das transcrições serão reunidos em transcrições usando um programa de montagem de transcrições de leitura curta. Como as transcrições podem ser semelhantes, mas ter variações de aminoácidos, essas variações podem refletir diferentes isoformas de proteínas. Vários programas de montagem podem ser usados para executar esse processo, mas a montagem do transcriptoma apresenta muitos desafios específicos.
"A maioria dos montadores de leitura curta segue dois algoritmos básicos: gráfico de sobreposição e gráfico de Bruijn, sendo o gráfico de Bruijn o preferido devido aos seus requisitos computacionais relativamente baixos."
Notas Funcionais
A anotação funcional de transcrições montadas pode fornecer uma compreensão aprofundada de suas potenciais funções biológicas. Usando ferramentas como o Blast2GO, dados de sequência não anotados podem ser extraídos com base na ontologia genética. Esse processo pode ajudar a identificar os processos biológicos nos quais as transcrições estão envolvidas e suas funções moleculares.
Validação e Controle de Qualidade
Como é raro ter um bom genoma de referência disponível, a qualidade da sequência montada precisa ser verificada comparando-a com as leituras brutas. A filtragem de sequências curtas também é necessária porque essas sequências curtas geralmente não conseguem se dobrar efetivamente em proteínas funcionais.
Escolha um Montador
Existem muitos softwares de montagem disponíveis no mercado que podem ser usados para gerar transcriptomas. Por exemplo, ferramentas como SOAPdenovo-Trans e Trinity têm suas próprias características únicas. Esses programas podem não apenas montar transcrições de forma eficiente, mas também levar em conta diferentes eventos de splicing e níveis de expressão genética.
Neste campo em rápida evolução, a escolha do método de montagem do genoma ou do transcriptoma depende, em última análise, das necessidades do pesquisador e das características do organismo que está sendo estudado. Cada método tem suas vantagens e desvantagens. Os pesquisadores escolheram um caminho de pesquisa que melhor se adapta às suas necessidades?
