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Observando processos dinâmicos em células: como a imagem de fluorescência nos ajuda a entender a expressão genética?
A imagem de fluorescência é uma técnica de imagem não invasiva que nos ajuda a visualizar processos biológicos que ocorrem em organismos vivos. Essa técnica usa uma variedade de métodos, incluindo microscopia, sondas de imagem e espectroscopia para gerar imagens. Fluorescência é essencialmente um fenômeno de luminescência que ocorre quando uma substância absorve radiação eletromagnética e então libera luz de um comprimento de onda específico. Moléculas que podem emitir luz são chamadas fluoróforos. A imagem de fluorescência usa corantes fluorescentes e proteínas fluorescentes para marcar máquinas e estruturas moleculares, permitindo a observação experimental dos processos dinâmicos de expressão genética, expressão proteica e interações moleculares.
A imagem de fluorescência fornece uma ferramenta quantitativa precisa para aplicações bioquímicas.
Muitas vezes há um mal-entendido entre fluorescência e bioluminescência. A diferença entre as duas é o processo proteico que produz a luz. A bioluminescência é um processo químico que envolve enzimas que quebram substratos para produzir luz, enquanto a fluorescência é a excitação física de elétrons seguida pelo seu retorno ao estado fundamental para liberar luz.
Mecanismo de Fluorescência
Quando uma molécula absorve luz, a energia da molécula aumenta brevemente para um estado mais excitado. Quando ele retorna ao seu estado fundamental, ele emite luz fluorescente, que pode ser detectada e medida. O comprimento de onda específico da luz emitida depende da energia dos fótons absorvidos, portanto, esse comprimento de onda precisa ser conhecido antecipadamente no experimento para que o equipamento de medição possa detectar corretamente a geração de luz.
A fórmula para determinar o comprimento de onda de emissão de fluorescência é: λ emissão = hc / Emissão de energia
Aqui, h é a constante de Planck e c é a velocidade da luz. Normalmente, um grande dispositivo de digitalização ou CCD é usado para medir a intensidade e digitalizar a imagem.
Corantes fluorescentes e proteínas
Os corantes fluorescentes têm maior fotoestabilidade e brilho e não requerem tempo de maturação em comparação às proteínas fluorescentes. Em termos de brilho, o coeficiente de extinção (a capacidade de absorver luz) e a eficiência quântica (quão bem ele converte a luz absorvida em luz fluorescente) de um fluoróforo estão intimamente relacionados. O corante em si não é muito fluorescente, mas quando ligado a uma proteína, ele se torna mais detectável. Por exemplo, o NanoOrange pode se ligar às regiões de revestimento e hidrofóbicas das proteínas e não é afetado por agentes redutores.
As proteínas podem apresentar autofluorescência quando absorvem luz incidente de um comprimento de onda específico. Por exemplo, a proteína fluorescente verde (GFP) emite luz verde quando exposta à luz na faixa do azul ao ultravioleta. Proteínas fluorescentes são excelentes moléculas repórter que ajudam a localizar proteínas, observar a ligação de proteínas e quantificar a expressão genética.
Alcance de imagens
Como alguns comprimentos de onda de fluorescência estão além do alcance do olho humano, o CCD é usado para detectar a luz com precisão e formar uma imagem. Isso normalmente é feito na faixa de 300–800 nm. Uma vantagem dos sinais de fluorescência é que a relação entre a intensidade da luz emitida e o número de moléculas fluorescentes presentes é geralmente linear, exigindo essencialmente que a intensidade da luz incidente e o comprimento de onda permaneçam constantes. A imagem final geralmente é renderizada em formato de dados de 12 ou 16 bits.
Sistema de imagem
Os principais componentes de um sistema de imagem de fluorescência incluem: uma fonte de excitação (que pode produzir luz de amplo comprimento de onda ou luz laser), óptica de exibição de luz (usada para iluminar a amostra) e óptica de coleta de luz (geralmente composta de lentes, espelhos e filtros). ) e dispositivos de detecção, amplificação e visualização (como tubos fotomultiplicadores ou CCDs).Aplicações
A imagem de fluorescência tem sido amplamente utilizada em diferentes campos científicos, incluindo:
- SYBR Green é um corante comum usado para visualizar bandas de DNA em PCR (eletroforese em gel de agarose).
- Use imagens de fluorescência para auxiliar a navegação no transplante. Por exemplo, o Indian Teal pode ser usado em pacientes com câncer para detectar gânglios linfáticos.
- Na imagem de cálcio, moléculas fluorescentes são usadas para monitorar a atividade de células vivas no sistema nervoso.
Vantagens e Desvantagens
Embora a imagem de fluorescência tenha algumas vantagens, como operação não invasiva e alta sensibilidade, ela também apresenta alguns desafios, como branqueamento de fluorescência, sensibilidade ambiental e capacidades de resolução limitadas.Direções futuras
Cientistas estão trabalhando para desenvolver proteínas fluorescentes mais eficientes para melhorar o desempenho das sondas de imagem. Por meio de métodos como engenharia genética e estabilização ambiental, espera-se que a futura tecnologia de imagem de fluorescência alcance avanços em múltiplas dimensões.
A imagem de fluorescência oferece uma ampla gama de oportunidades para explorar o que está acontecendo dentro das células. Então, que novos fenômenos biológicos descobertas futuras podem revelar?
