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A magia dos fragmentos amplificados: como encontrar pistas importantes na pesquisa genética?
Em biologia molecular, um amplicon é um segmento de DNA ou RNA que é produzido por um evento de amplificação ou replicação. Esses fragmentos podem ser gerados artificialmente usando vários métodos, como reação em cadeia da polimerase (PCR) ou reação em cadeia da ligase (LCR), ou podem ser o resultado de duplicações genéticas naturais. A amplificação, conforme mencionada aqui, inclui a produção de múltiplas cópias de um segmento genético ou sequência alvo e, particularmente, refere-se ao próprio segmento amplificado.
A amplificação artificial tem aplicações em pesquisa, medicina forense e medicina para propósitos que incluem detecção e quantificação de patógenos infecciosos, identificação de restos mortais humanos e extração de genótipos de cabelo humano.
Duplicações genéticas naturais desempenham um papel importante na evolução e têm sido associadas a diversas formas de câncer humano, incluindo linfoma primário de células B do mediastino e linfoma de Hodgkin. Portanto, neste contexto, amplicon pode se referir não apenas a segmentos específicos de DNA cromossômico, mas também a segmentos que foram excisados, amplificados e reinseridos em outras partes do genoma, bem como segmentos de DNA extracromossômico conhecidos como diminigenes. , cada fragmento pode ser composto de um ou mais genes.
A amplificação dos genes codificados por esses fragmentos amplificados geralmente aumenta a eficiência de transcrição desses genes, levando, em última análise, a um aumento na quantidade de proteínas relacionadas.
Estrutura do fragmento amplificado
O amplicon é geralmente uma repetição direta (cabeça com cauda) ou invertida (cabeça com cabeça ou cauda com cauda) de uma sequência genética e pode ter estrutura linear ou circular. A estrutura do amplicon circular consiste em repetições invertidas imperfeitas que se coalescem condicionalmente para formar um círculo, presumivelmente formado a partir de um amplicon linear precursor. Ao amplificar artificialmente, o comprimento do fragmento amplificado depende do objetivo do experimento.
Avanços na Tecnologia de Amplificação
A análise de fragmentos amplificados tornou-se possível graças ao desenvolvimento de métodos de amplificação como a PCR, e cada vez mais surgiram tecnologias de sequenciamento de DNA de alta qualidade e alto rendimento, como a tecnologia de sequenciamento de semicondutores iônicos, que é frequentemente conhecido como A marca do desenvolvedor é chamada Ion Torrent. Essas tecnologias de sequenciamento tornaram possível estudar fragmentos de amplicons nas áreas de biologia genômica e genética, incluindo pesquisa genética do câncer, estudos filogenéticos e genética humana. Tome o gene 16S rRNA como exemplo. Esse gene faz parte do genoma de todas as bactérias e arqueias e é altamente conservado. Comparando a sequência do fragmento amplificado com a sequência conhecida, as bactérias podem ser classificadas.
Quase todo sequenciamento de fragmentos amplificados requer quantificação do produto amplificado, o que geralmente envolve uma etapa de captura e uma etapa de detecção, e os métodos de implementação específicos variam.
Aplicação de fragmentos amplificados
A PCR pode ser usada para determinar o sexo de uma amostra de DNA humano. Selecionando o sítio de inserção do elemento Alu para amplificação e avaliando o tamanho do fragmento, o teste de gênero usa AluSTXa para corresponder ao cromossomo X e AluSTYa para corresponder ao cromossomo Y. Este design pode efetivamente reduzir a possibilidade de erro. Quando a região homóloga é amplificada, o cromossomo inserido produzirá fragmentos maiores. Os machos podem ser distinguidos por terem dois fragmentos de amplificação de DNA, enquanto as fêmeas têm apenas um fragmento de amplificação. O pacote de métodos para este método inclui um par de primers para locais de amplificação e reagentes seletivos de reação em cadeia da polimerase. No diagnóstico da tuberculose, o LCR também tem sido usado como um teste, com a sequência alvo contendo o antígeno proteico B sendo alvo de quatro primers oligonucleotídicos para as fitas sentido e reversa, respectivamente.
Os produtos ou fragmentos amplificados são avaliados por meio de várias etapas de detecção e captura. Com o desenvolvimento do sequenciamento de amplicon, os vários fragmentos de amplicon gerados a partir de uma amostra comum são conectados e sequenciados, seguidos pela classificação de controle de qualidade e, finalmente, o número do mesmo tipo é calculado para refletir sua abundância relativa na amostra. Riqueza.
Com o avanço da tecnologia, os fragmentos amplificados se tornaram uma parte indispensável da pesquisa genética atual. Mas neste campo em rápida evolução, entendemos completamente o potencial dos fragmentos amplificados?
