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O segredo da reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa: como revelar a expressão gênica por meio do RNA?
A reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) é uma técnica laboratorial que combina a transcrição de RNA em DNA (neste contexto chamado DNA complementar ou cDNA) e a amplificação de um alvo de DNA específico. Este processo usa a cadeia da polimerase reação (PCR). Essa técnica é usada principalmente para medir a quantidade de RNA específico monitorando a fluorescência da reação de amplificação, que é chamada de PCR em tempo real ou PCR quantitativa (qPCR). Na literatura científica, RT-PCR é algumas vezes usado de forma confusa por alguns autores para se referir à PCR em tempo real. Neste artigo, nos referimos à RT-PCR especificamente como PCR de transcrição reversa.
Devido à sua simplicidade, alta especificidade e sensibilidade, a RT-PCR tem sido usada em uma ampla variedade de experimentos, desde a quantificação de células de levedura no vinho até a detecção de patógenos infecciosos.
Princípios e aplicações da RT-PCR
O princípio da RT-PCR é primeiro converter o molde de RNA em cDNA, que é então amplificado exponencialmente usando PCR. Essa mudança revolucionária no processo nos permite detectar transcrições de quase todos os genes e amplificar amostras, eliminando as grandes quantidades de material inicial necessárias ao usar o Northern blotting.
A RT-PCR se tornou uma das técnicas mais importantes, desde a análise da expressão genética até o diagnóstico de patógenos infecciosos. Por exemplo, cientistas estão estudando como usar RT-PCR para testes de câncer para melhorar o prognóstico e monitorar a resposta ao tratamento.
Por exemplo, células tumorais circulantes produzem transcrições de mRNA exclusivas dependendo do tipo de câncer, e a RT-PCR pode analisar os níveis de expressão dessas transcrições.
Evolução técnica da RT-PCR
Desde a primeira introdução do Northern blotting em 1977, embora a técnica tenha suas desvantagens na quantificação de RNA, como ser demorada e exigir grandes quantidades de RNA, a RT-PCR se tornou um método popular para detecção e quantificação de RNA desde a invenção do PCR por Kary Mullis em 1983. O método de escolha para quantificação. Esse processo não só não requer pós-processamento, mas também pode medir a abundância de RNA mais de 107 vezes, fornecendo ainda mais dados de qualidade e quantidade.Atualmente, a tecnologia RT-PCR desenvolveu diferentes modos de operação: uma parada e duas etapas. A RT-PCR em duas etapas requer que a transcrição reversa e a amplificação por PCR sejam realizadas em tubos de ensaio diferentes, enquanto a RT-PCR de uma etapa pode ser concluída em um tubo de ensaio. Embora o método de parada única seja mais conveniente para detecção rápida, ele é suscetível à degradação da amostra quando testes repetidos são realizados.
Desafios e direções futuras da RT-PCR
Embora a tecnologia RT-PCR tenha muitas vantagens, ela ainda enfrenta alguns desafios. Por exemplo, durante múltiplos ciclos de PCR, o crescimento exponencial do DNA complementar (cDNA) após a transcrição reversa produz quantificação imprecisa do ponto final, enquanto a qRT-PCR supera esse problema devido à adição da tecnologia de monitoramento de fluorescência. Além disso, a alta sensibilidade significa que até mesmo vestígios de contaminação de DNA podem distorcer os resultados. Portanto, é fundamental planejar e projetar fontes de variação na tecnologia.
Por exemplo, adicionar uma quantidade conhecida de RNA como amostra de referência pode ajudar os pesquisadores a realizar controles e análises quantitativas.
Com a evolução contínua da tecnologia, a RT-PCR tem amplo potencial de aplicação em diagnóstico genético, detecção de câncer e triagem precoce de doenças. É possível prever que, em futuras pesquisas científicas, essa tecnologia desempenhará um papel mais importante na compreensão das mudanças na expressão genética e dos mecanismos por trás delas.
Com o estudo aprofundado da tecnologia RT-PCR, como a aplicação dessa tecnologia na biologia genética mudará ainda mais nossa compreensão dos processos vitais?
