Language
Country/Area
No result found
Геном или транскриптом? Ключевое различие в выборе правильного метода сборки!
С развитием новых технологий секвенирования исследования транскриптома вступили в новую эру. Значительное снижение затрат на секвенирование, особенно в период с 2008 по 2012 год, позволило собирать и анализировать транскриптомы многих немодельных организмов. Это изменение выходит за рамки обнаружения фенотипических изменений у конкретных организмов, позволяя нам более полно понять разнообразие и биологические механизмы жизни на Земле.
«Самым большим преимуществом сборки транскриптома является ее потенциальная возможность выявлять новые белки и их изоформы, которые могут играть ключевую роль в определенных биологических явлениях».
Существует два основных метода сборки транскриптома: сборка de novo и сборка на основе референсных данных. Для немодельных организмов, для которых полный геном еще не установлен, сборка транскриптома de novo, очевидно, является более подходящим выбором. Этот подход не опирается на предыдущие последовательности генома, что позволяет исследователям изучать неизвестную информацию о транскрипции генов.
Сборка de novo против сборки на основе ссылок
Раньше анализ данных транскриптома основывался в первую очередь на сравнении с существующими референтными геномами. Однако этот подход может не охватывать все структурные вариации мРНК, особенно когда задействован альтернативный сплайсинг, и многие варианты транскриптов могут быть пропущены, поскольку их невозможно прерывисто сопоставить с геномом. Таким образом, даже при наличии референтного генома все равно необходимо выполнить сборку de novo, поскольку новая сборка может восстановить транскрипты, отсутствующие в референтном геноме.
Транскриптом и сборка генома
Глубина покрытия транскриптома может напрямую отражать уровень экспрессии гена, тогда как на глубину покрытия генома обычно влияют повторяющиеся последовательности. Кроме того, одной из самых больших проблем, с которыми сталкивается сборка транскриптома, является то, что различные варианты транскрипта в одном и том же гене могут иметь общие экзоны, что затрудняет их идентификацию.
Методы сборки транскриптома
РНК-секвенированиеПосле выделения и очистки РНК образцы будут отправлены на установку высокопроизводительного секвенирования для обратной транскрипции с целью получения библиотеки кДНК. В зависимости от платформы эти кДНК будут разрезаны на отрезки определенной длины, а затем секвенированы с использованием различных технологий, включая секвенирование 454, Illumina и SOLiD.
Алгоритм сборки
Данные о последовательностях транскриптов будут собраны в транскрипты с использованием программы сборки транскриптов с коротким прочтением. Поскольку транскрипты могут быть похожими, но иметь аминокислотные вариации, эти вариации могут отражать различные изоформы белка. Для выполнения этого процесса можно использовать ряд программ сборки, но сборка транскриптома сопряжена со многими уникальными трудностями.
«Большинство ассемблеров с коротким чтением следуют двум основным алгоритмам: граф перекрытия и граф де Брейна, причем граф де Брейна предпочтительнее из-за его относительно низких вычислительных требований».
Функциональные примечания
Функциональная аннотация собранных транскриптов может обеспечить глубокое понимание их потенциальных биологических функций. Используя такие инструменты, как Blast2GO, можно извлекать неаннотированные данные о последовательностях на основе онтологии генов. Этот процесс может помочь определить биологические процессы, в которых участвуют транскрипты, и их молекулярные функции.
Проверка и контроль качества
Поскольку хороший референсный геном доступен редко, качество собранной последовательности необходимо проверить, сравнив ее с необработанными прочтениями. Фильтрация коротких последовательностей также необходима, поскольку эти короткие последовательности обычно не могут эффективно складываться в функциональные белки.
Выберите ассемблер
На рынке доступно множество программ для сборки, которые можно использовать для генерации транскриптомов. Например, такие инструменты, как SOAPdenovo-Trans и Trinity, имеют свои уникальные особенности. Эти программы могут не только эффективно собирать транскрипты, но и учитывать различные события сплайсинга и уровни экспрессии генов.
В этой быстро развивающейся области выбор метода сборки генома или транскриптома в конечном итоге зависит от потребностей исследователя и характеристик изучаемого организма. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Выбрали ли исследователи путь исследования, который лучше всего соответствует их потребностям?
