Language
Country/Area
No result found
Артефакт репликации жизни: почему термостабильная ДНК-полимераза является звездой ПЦР?
В области генной инженерии и молекулярной биологии появление термостабильной ДНК-полимеразы, несомненно, является революционным прорывом. Эти ферменты термофильных организмов способствовали быстрому развитию технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ее широкому применению в репликации генов, генной терапии и многих других областях биотехнологии.
Терстабильные ДНК-полимеразы обладают естественным свойством, которое позволяет им сохранять функциональность при высоких температурах, что делает ПЦР менее необходимой при частом добавлении фермента.
Характеристики термостабильных ДНК-полимераз
Терстабильные ДНК-полимеразы обычно получают из термофильных бактерий или архей, и эти ферменты обладают превосходной активностью при высоких температурах. Большинство этих полимераз обладают 5'→3' полимеризационной активностью и обладают либо 5'→3', либо 3'→5' экзонуклеазной активностью.
Его структура и функции
Эти полимеразы имеют форму руки с большим пальцем, ладонью и остальными пальцами. Функция большого пальца заключается в связывании и перемещении двухцепочечной ДНК, ладонь несет активный центр полимеразы, а пальцы отвечают за связывание субстратов, таких как ДНК-матрица и нуклеотидтрифосфаты.
Полимеразы из разных источников
Среди бактериальных термостабильных ДНК-полимераз фермент Taq широко используется благодаря своей превосходной производительности. Кроме того, существуют такие полимеразы, как Tfl, Tma, Tne, Tth и Bst. Напротив, архейные полимеразы включают Pfu, Pwo и т. д. Большинство этих полимераз обладают способностью исправлять ошибки синтеза, а именно 3'→5' экзонуклеазной активностью.
Было показано, что использование смеси архейных и бактериальных полимераз позволяет эффективно синтезировать фрагменты ДНК длиной до 35 кб в ПЦР с самым большим диапазоном.
Скорость полимеразы и мощность обработки
Скорость синтеза различных полимераз сильно различается. Например, Taq-полимераза синтезирует со скоростью 60 нуклеотидов в секунду, тогда как KOD-полимераза может синтезировать со скоростью 120 нуклеотидов в секунду. Эти свойства влияют на эффективность и выход реакции при применении ПЦР.
Частота ошибок и доходность
Частота ошибок является важным показателем оценки качества полимеразы. Частота ошибок Taq-полимеразы составляет около 8 ошибок на тысячу нуклеотидов, тогда как частота ошибок Pfu-полимеразы составляет менее 1 ошибки. В целом, бактериальные полимеразы дают более высокий выход, но с большим количеством ошибок репликации, в то время как архейные полимеразы производят меньше, но более чистую ДНК.
Области применения
Помимо применения в технологии ПЦР, термостабильные ДНК-полимеразы также продемонстрировали свою важность во многих областях биологии, включая транскрипцию РНК, количественную ПЦР (КПЦР), мгновенный индивидуальный мутагенез и секвенирование ДНК. Эти методы помогают ученым глубже понять фундаментальные компоненты жизни и принципы их работы. Историческая справка
В 1976 году Элис Чиен впервые охарактеризовала термостабильную полимеразу Taq, а в 1988 году Рэндалл К. Сайки внедрил ее в технологию ПЦР, что ознаменовало собой существенное изменение в технологии репликации генов. В последующие годы клонирование генов и совершенствование полимеразы, а также применение различных высокоэффективных технологий ПЦР продолжали развиваться.
Со временем все больше исследований будут сосредоточены на том, как еще больше улучшить производительность термостабильных ДНК-полимераз для удовлетворения растущих научных потребностей.
Однако с развитием термостабильных ДНК-полимераз продолжают возникать новые проблемы, например, как еще больше повысить их точность и эффективность в редактировании генов и синтетической биологии. Эти вопросы заставляют нас задуматься, как будущие полимеразы будут решать эти проблемы?
