Language
Country/Area
No result found
Наблюдение за динамическими процессами в клетках: как флуоресцентная визуализация помогает нам понять экспрессию генов?
Флуоресцентная визуализация — это неинвазивный метод визуализации, который помогает нам визуализировать биологические процессы, происходящие в живых организмах. В этой методике для получения изображений используются различные методы, включая микроскопию, зондирование изображений и спектроскопию. Флуоресценция — это по сути явление люминесценции, которое возникает, когда вещество поглощает электромагнитное излучение, а затем испускает свет определенной длины волны. Молекулы, способные излучать свет, называются флуорофорами. Флуоресцентная визуализация использует флуоресцентные красители и флуоресцентные белки для маркировки молекулярных механизмов и структур, что позволяет экспериментально наблюдать динамические процессы экспрессии генов, экспрессии белков и молекулярных взаимодействий.
Флуоресцентная визуализация представляет собой точный количественный инструмент для биохимических исследований.
Часто возникает недопонимание между флуоресценцией и биолюминесценцией, поскольку разница между ними заключается в белковом процессе, который производит свет. Биолюминесценция — это химический процесс, в котором ферменты расщепляют субстраты для получения света, тогда как флуоресценция — это физическое возбуждение электронов с последующим их возвращением в основное состояние для высвобождения света.
Механизм флуоресценции
Когда молекула поглощает свет, ее энергия на короткое время повышается до более возбужденного состояния. Когда он впоследствии возвращается в свое основное состояние, он излучает флуоресцентный свет, который можно обнаружить и измерить. Конкретная длина волны излучаемого света зависит от энергии поглощенных фотонов, поэтому эту длину волны необходимо знать заранее в ходе эксперимента, чтобы измерительное оборудование могло правильно обнаружить генерацию света.
Формула для определения длины волны флуоресцентного излучения: λ излучение = hc / Энергия излучения
Здесь h — постоянная Планка, а c — скорость света. Обычно для измерения интенсивности и оцифровки изображения используется большое сканирующее устройство или ПЗС-матрица.
Флуоресцентные красители и белки
Флуоресцентные красители обладают более высокой фотостабильностью и яркостью и не требуют времени созревания по сравнению с флуоресцентными белками. С точки зрения яркости коэффициент экстинкции (способность поглощать свет) и квантовая эффективность (насколько хорошо он преобразует поглощенный свет во флуоресцентный) флуорофора тесно связаны. Сам по себе краситель не очень флуоресцентен, но когда он связан с белком, его становится легче обнаружить. Например, NanoOrange может связываться с покрытием и гидрофобными областями белков и не подвержен воздействию восстановителей.
Белки могут автофлуоресцировать, поглощая падающий свет определенной длины волны. Например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) излучает зеленый свет при воздействии света в диапазоне от синего до ультрафиолетового. Флуоресцентные белки — прекрасные репортерные молекулы, которые помогают обнаруживать белки, наблюдать связывание белков и количественно определять экспрессию генов.
Диапазон изображения
Поскольку некоторые длины волн флуоресценции выходят за пределы диапазона человеческого глаза, для точного обнаружения света и формирования изображения используется ПЗС. Обычно это делается в диапазоне 300–800 нм. Одним из преимуществ сигналов флуоресценции является то, что зависимость между интенсивностью излучаемого света и числом присутствующих флуоресцентных молекул, как правило, линейная, что по сути требует, чтобы интенсивность падающего света и длина волны оставались постоянными. Конечное изображение обычно визуализируется в 12- или 16-битном формате данных.
Система визуализации
Основные компоненты системы флуоресцентной визуализации включают: источник возбуждения (который может генерировать свет с широкой длиной волны или лазерный свет), оптику светового отображения (используется для освещения образца) и оптику сбора света (обычно состоит из линз, зеркал и фильтров). ), а также устройства обнаружения, усиления и визуализации (такие как фотоумножительные трубки или ПЗС).Приложения
Флуоресцентная визуализация широко используется в различных научных областях, включая:
<ул>Преимущества и недостатки
Хотя флуоресцентная визуализация имеет некоторые преимущества, такие как неинвазивность и высокая чувствительность, она также имеет некоторые недостатки, такие как обесцвечивание флуоресценции, чувствительность к окружающей среде и ограниченные возможности разрешения.Будущие направления
Ученые работают над созданием более эффективных флуоресцентных белков для улучшения производительности зондов визуализации. Ожидается, что благодаря таким методам, как генная инженерия и стабилизация окружающей среды, будущая технология флуоресцентной визуализации достигнет прорывов в нескольких измерениях.
Флуоресцентная визуализация предоставляет широкий спектр возможностей для изучения того, что происходит внутри клеток. Так какие же новые биологические явления могут открыть будущие открытия?
