Language
Country/Area
No result found
Магия лигирования ДНК: что такое ДНК-лигаза и как она влияет на наш геном?
Целостность ДНК имеет решающее значение для построения жизни, и ДНК-лигаза играет важную роль в поддержании этой целостности. Основная функция этого фермента — соединение двух нуклеотидов или фрагментов нуклеиновой кислоты в единую полимерную цепь. Этот процесс называется лигированием. Однако это не просто простой процесс в биологии, он играет важнейшую роль в функционировании и изменении генома.
Реакция лигирования включает образование фосфодиэфирной связи между 3'-гидроксильным концом одного нуклеотида и 5'-фосфатным концом другого нуклеотида, тем самым соединяя два нуклеотида в одну цепь. Открытие этого процесса датируется 1967 годом и стало ключевым событием в области молекулярной биологии.
Соединение происходит естественным образом у большинства организмов в ходе процессов репликации, транскрипции, сплайсинга и рекомбинации ДНК. Методы молекулярного клонирования в лабораторных условиях используют ДНК-лигазу для создания рекомбинантных молекул ДНК, например, при вставке чужеродных фрагментов ДНК в плазмиды.
В лаборатории процесс лигирования в основном осуществляется ДНК-лигазой Т4. Его широкое применение обусловлено его способностью лигировать фрагменты как с липкими, так и с тупыми концами. Однако существует ряд методов лигирования, не использующих стандартные ДНК-лигазы, которые также популярны. Дефекты лигазы связаны с такими патологическими состояниями, как иммунодефицит, чувствительность к радиации и проблемы развития.
Механизм реакции лигирования
Механизм реакции лигирования был впервые раскрыт исследовательской группой И. Роберта Лемана. ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирных связей в цепях ДНК. Этот процесс инициируется реакцией АТФ или НАД+ с образованием промежуточного продукта лигаза-АМФ, который затем переносит АМФ на 5'-конец цепи ДНК, в конечном итоге достигая соединения два конца ДНК.
У животных и бактериофагов источником энергии для реакции лигирования служит АТФ, тогда как у бактерий используется НАД+. В реакции лигирования ДНК-лигаза сначала реагирует с АТФ или НАД+, образуя промежуточное соединение лигаза-АМФ.
Процесс лигирования ДНК также включает некоторые важные факторы, включая концентрацию фермента, концентрацию субстрата реакции, температуру реакции и время инкубации. Эти факторы влияют на эффективность химических реакций, опосредованных ферментами, и, следовательно, на конечные результаты лигирования.
Факторы, влияющие на связи
В лаборатории существует множество факторов, влияющих на реакцию лигирования. Например, концентрация ДНК может напрямую влиять на скорость лигирования. Относительно высокие концентрации ДНК увеличивают вероятность встречи и соединения различных фрагментов ДНК друг с другом, тогда как более низкие концентрации могут привести к самозамыканию внутренних связей. На этом этапе реактору необходимо найти баланс между фрагментами ДНК и их длиной.
В реакции лигирования высокие концентрации ДНК могут привести к повышению эффективности лигирования экзогенных вставок, тогда как низкие концентрации с большей вероятностью приведут к циклическим внутренним реакциям.
Помимо концентрации ДНК, на скорость реакции влияет также концентрация лигазы. По мере увеличения концентрации фермента скорость лигирования обычно увеличивается. Вот почему использование высоких концентраций лигазы позволяет добиться хороших экспериментальных результатов за более короткое время.
Лигирование липких концов к тупым
В процессе лигирования лигирование липких концов более эффективно, чем лигирование тупых концов. Это происходит потому, что липкие концы способны образовывать комплементарные пары, тем самым увеличивая вероятность лигирования. С другой стороны, тупые концы при лигировании опираются на случайные столкновения и поэтому менее эффективны.
Эффективность реакции лигирования липких концов обычно в 100 раз выше, чем эффективность реакции лигирования тупых концов. Поэтому в случаях с тупыми концами вставок часто необходимо увеличивать концентрацию лигазы, чтобы компенсировать потерю эффективности.
На самом деле, неосторожное использование или обращение с лигазами, такими как CIAP, может привести к неудаче лигирования. Успех этого процесса зависит от многих факторов, ни один из которых нельзя игнорировать. При возникновении трудностей для обеспечения успеха эксперимента крайне важно уметь устранять основные неполадки.
Другие методы подключения и приложения
Сегодня многие коммерческие инструменты для клонирования ДНК больше не полагаются на традиционные ДНК-лигазы, а вместо этого используют другие методы, такие как лигирование с помощью топоизомеразы или гомологичную рекомбинацию. Эти методы, как правило, ускоряют процесс клонирования и обеспечивают большую гибкость, но они также требуют использования специально разработанных векторов и компонентов.
В области генной инженерии открытие и применение ДНК-лигазы не только способствовало прогрессу фундаментальных исследований, но и предоставило возможности для инноваций в области медицины, например, продемонстрировав ее потенциал в лечении генетических заболеваний. . Перед лицом этих технологических достижений мы не можем не задаться вопросом: как эта геномная магия сформирует будущее биомедицины?
