Language
Country/Area
No result found
Таинственное очарование FLIM-микроскопии: как использовать время жизни флуоресценции для раскрытия секретов микросреды?
В научных исследованиях понимание микроскопической среды имеет решающее значение, особенно в областях биологии и химии. Микроскопия с визуализацией прижизненной флуоресценции (FLIM) — это мощный метод, который позволяет глубоко проникнуть в тайны микросреды и открыть для нас совершенно новое окно. В этой статье мы рассмотрим, как работает FLIM и как он может предоставить бесценную информацию для исследований.
Основные принципы FLIM
FLIM в своей основе использует время жизни флуоресцентных молекул, а не интенсивность их излучения для создания изображений. Другими словами, FLIM позволяет измерять время жизни флуоресцентных молекул, которое тесно связано с характеристиками локальной микросреды. Таким образом, FLIM может эффективно устранять ошибки, вызванные изменениями яркости источника света, интенсивностью фонового освещения или ограниченным фотообесцвечиванием.
Время жизни флуоресценции зависит от свойств микросреды и, следовательно, может дать представление о pH, вязкости и концентрации химических веществ.
Время жизни флуоресценции
Когда флуоресцентная молекула возбуждается фотоном, она с определенной вероятностью вернется в основное состояние посредством нескольких путей распада, по крайней мере один из которых — испускание фотонов посредством спонтанного излучения. В FLIM процесс затухания флуоресценции следует экспоненциальному затуханию, которое можно описать следующим образом:
I(t) = I0 * e^(-t/τ)
Где τ представляет собой время жизни флуоресценции. Ключевым моментом здесь является то, что это измерение времени жизни не зависит от начальной интенсивности флуоресценции, что позволяет проводить измерения без привязки к интенсивности в химическом зондировании.
Технология измерения
Во время визуализации FLIM интенсивность каждого пикселя на изображении определяется временем жизни флуоресценции, что позволяет нам наблюдать контрасты между материалами с разной скоростью затухания даже на одной и той же длине волны, а также наблюдать изменения пути затухания FRET при визуализации.
Метод импульсного возбуждения
Метод импульсного возбуждения широко используется в технологии FLIM. После возбуждения флуоресцентных молекул ультракороткими лазерными импульсами разрешенная во времени флуоресценция демонстрирует экспоненциальный спад. Однако из-за существования функции отклика прибора фактически измеренный сигнал флуоресценции не будет представлять собой чисто экспоненциальный спад. Для решения этой проблемы часто используется технология подсчета одиночных фотонов с временной корреляцией (TCSPC), которая позволяет компенсировать изменения интенсивности источника света и амплитуды однофотонного импульса.
Используя коммерческое устройство TCSPC, можно регистрировать кривые затухания флуоресценции с временным разрешением до 405 фс.
Метод фазовой модуляции
Другой метод — фазовая модуляция. В этом методе используется высокочастотный лазерный источник, а изменение фазы его флуоресцентного сигнала напрямую связано с продолжительностью жизни флуоресцентных молекул, что обеспечивает более высокую скорость получения изображений при исследовании живых клеток.
Методы анализа
Данные, полученные с помощью FLIM, необходимо проанализировать с помощью соответствующих алгоритмов, чтобы извлечь чистую кривую затухания и оценить время жизни. Обычно используемые методы включают метод наименьших квадратов и итеративную обратную свертку. Как эффективно сопоставить фактическое измерение с ожидаемой моделью — одна из проблем в обработке данных FLIM.
Основная цель этого метода — извлечь чистую кривую затухания путем минимизации взвешенной суммы остатков.
Перспективы на будущее
Технология FLIM находит все большее применение с появлением новых инструментов визуализации, особенно при наблюдении в реальном времени за изменениями внутри живых клеток и их микросреды. Стремление научного сообщества глубже понять химические изменения внутри клеток продолжает стимулировать развитие этой технологии.
С развитием технологии FLIM будут исследованы многие неразгаданные тайны. Как будущие исследования еще больше раскроют тайны микросреды?
