Language
Country/Area
No result found
Sức hấp dẫn bí ẩn của kính hiển vi FLIM: Làm thế nào để sử dụng thời gian sống huỳnh quang để phát hiện bí mật của môi trường vi mô?
Trong nghiên cứu khoa học, việc hiểu biết về môi trường vi mô là rất quan trọng, đặc biệt là trong lĩnh vực sinh học và hóa học. Kính hiển vi hình ảnh huỳnh quang suốt đời (FLIM) là một kỹ thuật mạnh mẽ có thể thăm dò sâu vào những bí mật của môi trường vi mô và mở ra một cửa sổ hoàn toàn mới cho chúng ta. Bài viết này sẽ khám phá cách thức hoạt động của FLIM và cách nó có thể cung cấp những hiểu biết vô giá trong nghiên cứu.
Nguyên lý cơ bản của FLIM
FLIM về cơ bản dựa vào thời gian sống của các phân tử huỳnh quang hơn là cường độ phát xạ của chúng để tạo ra hình ảnh. Nói cách khác, FLIM có khả năng đo thời gian sống của các phân tử huỳnh quang, có liên quan chặt chẽ đến đặc điểm của môi trường vi mô tại địa phương. Do đó, FLIM có thể loại bỏ hiệu quả các lỗi gây ra bởi sự thay đổi độ sáng của nguồn sáng, cường độ ánh sáng nền hoặc hiện tượng tẩy trắng ảnh hạn chế.
Tuổi thọ huỳnh quang phụ thuộc vào đặc tính của môi trường vi mô và do đó có thể cung cấp thông tin về độ pH, độ nhớt và nồng độ hóa chất.
Tuổi thọ huỳnh quang
Khi một phân tử huỳnh quang bị kích thích bởi một photon, nó sẽ trở lại trạng thái cơ bản thông qua nhiều con đường phân rã với một xác suất nhất định, trong đó ít nhất một trong số đó là phát ra photon thông qua bức xạ tự phát. Trong FLIM, quá trình phân rã huỳnh quang tuân theo sự phân rã theo cấp số nhân có thể được mô tả như sau:
I(t) = I0 * e^(-t/τ)
Trong đó, τ biểu thị thời gian sống huỳnh quang. Điểm mấu chốt ở đây là phép đo thời gian sống này không phụ thuộc vào cường độ huỳnh quang ban đầu, do đó cho phép thực hiện các phép đo không tham chiếu cường độ trong cảm biến hóa học.
Công nghệ đo lường
Trong quá trình chụp ảnh FLIM, cường độ của từng điểm ảnh trong ảnh được xác định bởi thời gian sống huỳnh quang, cho phép chúng ta quan sát độ tương phản giữa các vật liệu có tốc độ phân rã khác nhau ngay cả ở cùng bước sóng và quan sát thêm những thay đổi của con đường suy giảm FRET trong quá trình chụp ảnh.
Phương pháp kích thích xung
Phương pháp kích thích xung được sử dụng rộng rãi trong công nghệ FLIM. Sau khi kích thích các phân tử huỳnh quang bằng các xung laser cực ngắn, huỳnh quang phân giải theo thời gian biểu hiện sự phân rã theo cấp số nhân. Tuy nhiên, do sự tồn tại của hàm phản hồi của thiết bị nên tín hiệu huỳnh quang thực sự được đo sẽ không phải là sự phân rã theo cấp số nhân thuần túy. Để giải quyết vấn đề này, công nghệ đếm photon đơn tương quan thời gian (TCSPC) thường được sử dụng, có thể bù đắp cho những thay đổi về cường độ nguồn sáng và biên độ xung photon đơn.
Khi sử dụng thiết bị TCSPC thương mại, đường cong phân rã huỳnh quang có thể được ghi lại với độ phân giải thời gian lên tới 405 fs.
Phương pháp điều chế pha
Một kỹ thuật khác là điều chế pha. Phương pháp này sử dụng nguồn laser tần số cao và sự thay đổi pha của tín hiệu huỳnh quang có liên quan trực tiếp đến thời gian sống của các phân tử huỳnh quang, cho phép tốc độ chụp ảnh nhanh hơn trong nghiên cứu tế bào sống.
Phương pháp phân tích
Dữ liệu do FLIM tạo ra cần được phân tích bằng các thuật toán thích hợp để trích xuất đường cong phân rã thuần túy và ước tính tuổi thọ. Các kỹ thuật thường dùng bao gồm phương pháp bình phương nhỏ nhất và phép tính tích chập lặp lại. Làm thế nào để khớp hiệu quả phép đo thực tế với mô hình mong đợi là một trong những thách thức trong xử lý dữ liệu FLIM.
Mục tiêu chính của kỹ thuật này là trích xuất đường cong phân rã thuần túy bằng cách giảm thiểu tổng trọng số của các phần dư.
Triển vọng tương lai
Công nghệ FLIM ngày càng được sử dụng nhiều hơn với sự ra đời của các thiết bị hình ảnh mới, đặc biệt là trong việc quan sát thời gian thực những thay đổi bên trong tế bào sống và môi trường vi mô của chúng. Mong muốn của cộng đồng khoa học trong việc hiểu sâu hơn về những thay đổi hóa học bên trong tế bào tiếp tục thúc đẩy sự tiến bộ của công nghệ này.
Với sự phát triển của công nghệ FLIM, nhiều bí ẩn chưa được giải đáp sẽ được khám phá. Nghiên cứu trong tương lai sẽ tiếp tục tiết lộ những bí ẩn của môi trường vi mô như thế nào?
