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从膳食到科学：你知道酶如何切割蛋白质成为小片段吗？
在生物学中，蛋白质是生命活动的重要角色，而对蛋白质的分析能够揭示其功能及结构。一种被广泛使用的分析技巧称为肽质量指纹（Peptide Mass Fingerprinting, PMF），这种技术能够帮助研究者识别未知蛋白质的特性。在PMF中，目标蛋白质会首先被切割成较小的肽段，接着这些肽的品质可以用像MALDI-TOF和ESI-TOF等质谱仪精确测量。
肽质量指纹技术的出现，显著简化了蛋白质识别的过程，使得科学家能够在较短的时间内分析复杂的蛋白质样本。
PMF方法于1993年被几个研究团队独立开发，这一方法的核心是将未知蛋白质的质量与已知蛋白质的质量进行比较。这一过程需要使用计算机程序，这些程序可以将所研究生物的基因组转译为蛋白质，然后理论上将其切割为肽段，并计算出每个肽段的质量。接着，他们将未知蛋白质的肽段质量与基因组编码的每个蛋白质的理论肽质量进行比较，最终透过统计分析找出最佳匹配。
肽质量指纹技术的起源
由于分析蛋白质的过程繁琐，肽质量指纹技术应运而生。在这之前，Edman降解法被用于蛋白质分析，但分析一个氨基酸残基需时近一小时。另外，SDS-PAGE技术用来分离复杂混合物中的蛋白质，过程中还涉及电转印和染色等步骤。然而，这样的过程中经常出现的问题是干扰蛋白质与目标蛋白质一起纯化，这使得分析更加困难。因此，对已知的蛋白质污染物的序列进行编码并将其纳入所谓的Dayhoff资料库，能够减少仪器的分析时间和费用。
样品准备过程
在进行肽质量指纹分析之前，蛋白质样品通常来自SDS-PAGE或反相HPLC，并需要经过一些化学修饰。蛋白质中的二硫键会被还原，半胱氨酸氨基酸则会经过化学方法进行羧基甲基化或丙烯酰化。接着，使用诸如胰蛋白酶、洛伐他汀或Glu-C等蛋白酶将蛋白质切割为多个片段。一般而言，样品与酶的比例为50:1。蛋白质的水解一般需要过夜，随后利用乙腈萃取出产生的肽，并在真空下干燥。这些肽随后会溶解于少量的蒸馏水中，或进一步浓缩和纯化，准备进行质谱分析。
质谱分析
消化后的蛋白质可以通过不同类型的质谱仪进行分析，如ESI-TOF或MALDI-TOF。 MALDI-TOF通常是首选仪器，因为它能够实现高样品通量，在单次实验中分析多个蛋白质。如果结合使用MS/MS分析，则其效果尤为显著。在进行MALDI-TOF分析时，通常将少量的肽（通常不超过1微升）置于MALDI目标上，并加入一种被称为基质的化学物质。常用的基质包括肉桂酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸和2,3-二羟基苯甲酸等。这些基质分子有助于肽分子的脱附。
基质和肽分子在MALDI目标上共同结晶，然后准备进入质谱分析。 MALDI-MS的取样技术主要是干燥水滴技术。质谱仪会插入真空腔中，并由脉冲激光的火光触发聚合物片段的脱附和电离。通过这一过程，质量和电荷的比例可根据它们在漂移管中的飞行时间进行计算。
计算分析过程
质谱分析后会产生一份质量清单，通常称为峰清单。这些肽的质量将与包含蛋白质序列信息的数据库进行比较，如Swissprot等。计算机软件会对数据库中的蛋白质进行「在计算上消化」，以便与在化学裂解反应中使用的相同酶（如胰蛋白酶）进行比较。这些肽的质量会被计算出来并与测量到的质量峰清单进行比较。结果进行统计分析后，可能的匹配将返回结果表。
未来的方向
肽质量指纹技术代表了生物学和化学分析中一个重要的进步。然而，随着技术的进步，对于样品的要求与数据库的更新仍然是未来研究的重要方向。多元组合的样本和新型质谱仪的出现，将不断挑战和扩展这一技术的边界。在探索这些技术的进步过程中，我们是否能找到更有效、更准确的方式来识别和分析蛋白质呢？
