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RNA-Seq的奥秘：如何透视生命的基因表达？
在分子生物学的领域中，RNA-Seq（RNA测序）已经改变了我们对于基因表达的理解。这项尖端技术利用高通量测序技术，能够揭示生物样本中RNA分子的存在与数量，从而提供基因表达的快照，即所谓的转录组。随着技术的进步，RNA-Seq可以深入探讨基因的各种变异，包括基因的拼接转录体、转录后修饰、基因融合、突变/SNP及其在不同处理下的表达差异。
RNA-Seq不仅可以分析mRNA转录本，还能针对各类RNA进行研究，诸如总RNA、小RNA（如miRNA及tRNA）以及核糖体分析。
传统上，基因表达研究多依赖于杂交式微阵列，其面临着交叉杂交伪影、对表达量低或高的基因量化不良等技术问题。因此，转录组学逐渐转向基于测序的方法，这一路径最终发展至现今的RNA-Seq。
方法
文库准备
准备一个互补DNA (cDNA) 文库的基本步骤包括：RNA分离、RNA选择/去除、cDNA合成等。在这些程序中，RNA从组织中分离并与去氧核糖核酸酶混合，以减少基因组DNA的量。
RNA质量与起始RNA的总量会在随后的文库准备、序列测定与分析过程中被考量。
接下来根据需求，选择保留整体RNA或针对特定RNA进行富集。此过程中，3'端聚腺苷酸尾的RNA主要由成熟的编码序列组成。不过，聚腺苷酸选择的局限性在于，某些类型的RNA（如非编码RNA和组蛋白核糖体转录物）无法被检测。
cDNA序列测定 (cDNA-Seq)
接着，来源于RNA类型的cDNA文库会被序列化为可以被计算机解码的格式。包括Illumina与PacBio等公司的高通量测序技术普遍应用于这一阶段。
Illumina短片段测序技术广泛使用于cDNA测序，序列为合成后的每个步骤都伴随着激光激发灯的照射。
小RNA/非编码RNA测序
当要测序的RNA不为mRNA时，文库准备则需调整，确保是基于所需大小范围的RNA进行选择。这通常用于小RNA或特定RNA的富集。
直接RNA测序
利用直接RNA测序技术，研究者们能在不进行转录到cDNA的情况下，对RNA分子进行大量平行测序，这样可以避免在样本操作过程中可能产生的偏差和伪影。
单细胞RNA测序 (scRNA-Seq)
传统的分析方法通常集中于大样本，因此可能掩盖了细胞群体中个别细胞之间的差异。而单细胞RNA测序则提供了个别细胞的表达谱，揭示了以往未曾见过的稀少细胞类型。
例如，2018年透过scRNA-Seq在肺部气道上皮组织中识别到了稀有的特化细胞—肺离子细胞。
应用
scRNA-Seq正在广泛应用于不同的生物学领域包括发展生物学、神经学、肿瘤学、自身免疫疾病及感染性疾病等。这一技术使研究者能深入了解胚胎和生物体的发育过程。
分析
转录组组装
转录组组装方法主要有两种，分别为无参考组装及基因组辅导组装。无参考组装在基因组未知或不完整的情况下进行，挑战包括如何可靠地将短读数组合为一体。
基因组辅导组装当读段覆盖了基因组中的不连续部位。这些不连续读段是由于测序拼接转录体而产生的。
基因表达定量
基因表达的定量有助于研究细胞对外界刺激的响应，以及健康状态与疾病状态之间的差异。这些表达量通过计算与转录组构建步骤对应的读数来衡量。
RNA-Seq的读数计数技术已与更早的技术进行了彻底的验证，结果显示出其可靠性。
值得注意的是，RNA-Seq的深入分析要求对数据生成的具体参数有更高的掌握，从实验设计到数据管理均需谨慎对待。随着这项技术的日益成熟，各种生物学问题亦愈发可以用RNA-Seq来揭示，但这同时也引起了您对于生物学系统复杂性的思考吗？
