Language
Country/Area
No result found
T7 DNA聚合酶的神秘角色：它如何在病毒複製中扮演關鍵角色？
T7 DNA聚合酶是一種在T7噬菌體的DNA複製過程中使用的酶。在這個過程中，DNA聚合酶“讀取”現有的DNA鏈，並製造出兩條與之匹配的新鏈。此酶需要一個宿主因子，即大腸桿菌硫氧還原蛋白（thioredoxin），以便能夠發揮其功能。這種結合幫助穩定必要的蛋白質與引物-模板的結合，使得T7 DNA聚合酶的反應速度提高了超過100倍，這是目前為止此酶的獨特特徵。
它不僅是一種Family A DNA聚合酶的成員，還在定點突變與PCR等應用中具有多種用途。
機制
磷酸基轉移
T7 DNA聚合酶在進行T7噬菌體的DNA複製過程中催化磷酸基轉移。3'羥基的引物作為親核試劑攻擊核苷酸5'-三磷酸的磷酸二酯鍵，其中的反應除了增加新的核苷酸單磷酸到DNA中，還釋放出焦磷酸（PPi）。通常這個反應是金屬依賴型的，像Mg2+這類陽離子常常會出現在酶的活性位點。
當前文提到的T7 DNA聚合酶的指、手掌及拇指結構安置引物-模板，使得引物鏈的3'末端正好接近核苷酸結合位點。
活性位點中的Mg2+離子和氨基酸殘基的角色
活性位點中的氨基酸幫助建立穩定的環境，以便反應得以進行。一些氨基酸如Lys522、Tyr526、His506和Arg518充當氫鍵的供體。這些氨基酸的背骨羰基與Mg2+離子形成協調鍵，並幫助排列Mg2+離子以便引物與其攻擊。
輔助蛋白質
T7噬菌體的DNA複製過程相較於其他複製系統相對簡單。除了T7 DNA聚合酶，T7複製體還需要四個輔助蛋白質的協助，這些蛋白質分別是宿主的硫氧還原蛋白、gp4、gp2.5和gp1.7。
宿主硫氧還原蛋白
T7聚合酶單獨具有非常低的產率，在合併約15個核苷酸後就會從引物模板上解離。當感染宿主後，T7聚合酶會以1：1的比例與宿主硫氧還原蛋白結合，穩定其綁定。
gp4
gp4是一個包含兩個功能域的六聚體蛋白，分別是解旋酶域和引物酶域。解旋酶域用於解開雙鏈DNA，提供復制模板。
gp2.5與gp1.7
gp2.5的功能類似於單股DNA結合蛋白，能保護在複製過程中產生的單鏈DNA；gp1.7則催化去氧核苷單磷酸的轉化，是T7聚合酶對呋喃核苷酸敏感性的原因之一。
性能特徵
產率
T7 DNA聚合酶的gp5亞基單獨具有很低的載量，為了變得更加高效的產率，它招募宿主的硫氧還原蛋白形成复合体。這種硫氧還原蛋白-gp5的复合体提升了T7聚合酶對引物端的親和力。
外切酶活性
T7 DNA聚合酶擁有3'-5'的單股及雙股DNA外切酶活性。當新合成的碱基與模板鏈配對不正確時，此酶的外切酶活性將被啟動，執行異常碱基的切除，從而提高聚合酶的準確性。
應用
定點突變中的鏈延伸
利用定點突變技術，T7 DNA聚合酶可被用來進行特定的基因序列改變，克服了傳統DNA聚合酶的一些限制。
cDNA的第二鏈合成
T7 DNA聚合酶有助於在cDNA克隆技術中克服二鏈合成過程的某些限制，提供了高產率的全長第二鏈合成方法。
Sequenase（DNA序列測定）
在桑格測序中，T7 DNA聚合酶被改造以去除其外切酶活性，以提升其在DNA測序過程中的有效性，成為一種可靠的酶。
隨著科學技術的進步，T7 DNA聚合酶的應用範圍正在不斷擴大，你是否曾經思考過其在遺傳工程與治療研究中的潛在價值呢？
