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RNA-Seq的奧秘：如何透視生命的基因表達？
在分子生物學的領域中，RNA-Seq（RNA測序）已經改變了我們對於基因表達的理解。這項尖端技術利用高通量測序技術，能夠揭示生物樣本中RNA分子的存在與數量，從而提供基因表達的快照，即所謂的轉錄組。隨著技術的進步，RNA-Seq可以深入探討基因的各種變異，包括基因的拼接轉錄體、轉錄後修飾、基因融合、突變/SNP及其在不同處理下的表達差異。
RNA-Seq不僅可以分析mRNA轉錄本，還能針對各類RNA進行研究，諸如總RNA、小RNA（如miRNA及tRNA）以及核糖體分析。
傳統上，基因表達研究多依賴於雜交式微陣列，其面臨著交叉雜交伪影、對表達量低或高的基因量化不良等技術問題。因此，轉錄組學逐漸轉向基於測序的方法，這一路徑最終發展至現今的RNA-Seq。
方法
文庫準備
準備一個互補DNA (cDNA) 文庫的基本步驟包括：RNA分離、RNA選擇/去除、cDNA合成等。在這些程序中，RNA從組織中分離並與去氧核糖核酸酶混合，以減少基因組DNA的量。
RNA質量與起始RNA的總量會在隨後的文庫準備、序列測定與分析過程中被考量。
接下來根據需求，選擇保留整體RNA或針對特定RNA進行富集。此過程中，3'端聚腺苷酸尾的RNA主要由成熟的編碼序列組成。不過，聚腺苷酸選擇的局限性在於，某些類型的RNA（如非編碼RNA和組蛋白核糖體轉錄物）無法被檢測。
cDNA序列測定 (cDNA-Seq)
接著，來源於RNA類型的cDNA文庫會被序列化為可以被計算機解碼的格式。包括Illumina與PacBio等公司的高通量測序技術普遍應用於這一階段。
Illumina短片段測序技術廣泛使用於cDNA測序，序列為合成後的每個步驟都伴隨著激光激發燈的照射。
小RNA/非編碼RNA測序
當要測序的RNA不為mRNA時，文庫準備則需調整，確保是基於所需大小範圍的RNA進行選擇。這通常用於小RNA或特定RNA的富集。
直接RNA測序
利用直接RNA測序技術，研究者們能在不進行轉錄到cDNA的情況下，對RNA分子進行大量平行測序，這樣可以避免在樣本操作過程中可能產生的偏差和伪影。
單細胞RNA測序 (scRNA-Seq)
傳統的分析方法通常集中於大樣本，因此可能掩蓋了細胞群體中個別細胞之間的差異。而單細胞RNA測序則提供了個別細胞的表達譜，揭示了以往未曾見過的稀少細胞類型。
例如，2018年透過scRNA-Seq在肺部氣道上皮組織中識別到了稀有的特化細胞—肺離子細胞。
應用
scRNA-Seq正在廣泛應用於不同的生物學領域包括發展生物學、神經學、腫瘤學、自身免疫疾病及感染性疾病等。這一技術使研究者能深入瞭解胚胎和生物體的發育過程。
分析
轉錄組組裝
轉錄組組裝方法主要有兩種，分別為無參考組裝及基因組輔導組裝。無參考組裝在基因組未知或不完整的情況下進行，挑戰包括如何可靠地將短讀數組合為一體。
基因組輔導組裝當讀段覆蓋了基因組中的不連續部位。這些不連續讀段是由於測序拼接轉錄體而產生的。
基因表達定量
基因表達的定量有助於研究細胞對外界刺激的響應，以及健康狀態與疾病狀態之間的差異。這些表達量通過計算與轉錄組構建步驟對應的讀數來衡量。
RNA-Seq的讀數計數技術已與更早的技術進行了徹底的驗證，結果顯示出其可靠性。
值得注意的是，RNA-Seq的深入分析要求對數據生成的具體參數有更高的掌握，從實驗設計到數據管理均需謹慎對待。隨著這項技術的日益成熟，各種生物學問題亦愈發可以用RNA-Seq來揭示，但這同時也引起了您對於生物學系統複雜性的思考嗎？
