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Sanger測序的過去與NGS的未來：DNA測序如何從單一到並行？
在生物醫學領域，DNA測序技術經歷了重大的變革。自從Sanger測序的提出以來，為我們揭開了基因組的奧秘，而下一代測序（NGS）的出現則將這項技術推向了全新的高度。這種從單一到並行的技術跨越，不僅提高了測序的速度，也降低了測序的成本，從而改變了基因組學的研究面貌。
NGS的出現，讓我們能夠在短時間內獲得數以千萬計的基因組數據，這是Sanger測序無法比擬的。
NGS是指各種高通量的DNA測序方法，這些方法利用了大規模並行處理的概念。自1993年至1998年間，許多這類技術相繼出現，並於2005年完成商業化。這些技術允許每個儀器運行時產生從1百萬到43十億個短序列讀取。在這些平台中，技術配置和測序化學各有不同，但它們共享著一個共同的技術範式：通過空間上分離的、克隆增幅的DNA模板或單個DNA分子進行大規模並行測序。
與此同時，Sanger測序又稱為第一代測序，依賴電泳分離的末端產物。這種方法雖然歷史悠久，但在面對現今的科學需求時顯得力不從心。NGS的方法論讓我們得以一次性完成大規模的測序工作，為基因研究帶來了前所未有的效率和精確性。
NGS平台
使用商業可用的NGS平台進行DNA測序的過程通常分為幾個步驟：
- 通過體外PCR克隆擴增產生DNA測序文庫。
- 通過合成測序，根據互補鏈上核苷酸的增加來確定DNA序列。
- 空間上分離的、被擴增的DNA模板以大規模平行的方式同時進行測序，無需物理分離步驟。
這些步驟雖然在大多數NGS平台上相似，但每個平台的策略各不相同，這使得每個技術在市場上都有其獨特性和應用領域。
NGS的平行化測序反應能夠在一次儀器運行中生成數百兆到千兆的核苷酸序列讀取。這一變革大大提高了可用序列數據的量，使得醫學科學的基因組測序方法發生了根本性的變化。隨著新興的NGS技術和儀器的出現，測序的成本也顯著降低，接近每個基因組僅需1000美元的標準。
模板準備方法
進行NGS反應時，主要有兩種方法用於準備模板：來自單個DNA分子的增幅模板和單個DNA分子模板。
對於無法檢測單一螢光事件的成像系統，則需要對DNA模板進行擴增。常用的擴增方法有乳液PCR、滾環擴增和固相擴增等。
乳液PCR
在乳液PCR方法中，首先通過隨機碎片化基因組DNA產生DNA文庫，然後將單鏈DNA片段連接到帶有接頭的顆粒表面，襪開後每顆粒皆代表一個DNA片段。這些顆粒隨後被包裝到水油乳液微滴中，每個微滴都是一個PCR微反應器，在這裡產生增幅的單一DNA模板複本。
橋接擴增
在橋接擴增中，正反引物以高密度共價附著於流動胞的基底上。經過酶促延伸的試劑暴露後，配對模板在表面引物上延伸，最終完成在數百萬個不同位置的DNA聚合物的本地增幅，成為一個獨立的模板叢集。
單分子模板
單分子模板的準備相比之下更為直觀，這不需要PCR步驟。一般來說，單分子模板會被固定在固體支撐上，並用不同的方式進行擴增。如在第一種方式中，將空間上分佈的引物固定在固體支撐上，然後將已隨機切割的DNA片段與固定的引物雜交。
測序方法
NGS的測序方法各有特點，其中包括合成測序、焦磷酸測序和可逆終止子化學法等。合成測序的目的是通過檢測DNA聚合酶的核苷酸加入來確定樣本的序列。
可以說，失去了傳統Sanger測序所需的繁瑣步驟後，NGS提供了一個更高效的基因組研究范式。
隨著技術的發展，我們見證了DNA測序從早期的單一序列方法轉變為如今的並行處理模式，這不僅極大地提高了效率，更在成本和時間上帶來了前所未有的優勢。未來的DNA測序技術將會朝哪個方向發展？
