Language
Country/Area
No result found
الكيمياء السحرية لطريقة برادفورد: كيفية اكتشاف سر البروتين من خلال قطرة من الصبغة؟
منذ تطويره في عام 1976 بواسطة ماريون م. برادفورد، أصبح اختبار بروتين برادفورد أداة لا غنى عنها في البحث الكيميائي الحيوي. تتمكن هذه الطريقة الطيفية السريعة والدقيقة من قياس تركيز البروتينات في المحلول وهي معروفة باعتمادها على تركيب الأحماض الأمينية. إن طريقة برادفورد ليست بسيطة وسهلة الأداء فحسب، بل هي أيضًا حساسة للغاية، مما يجعلها تستخدم على نطاق واسع في المختبرات.
تعتمد طريقة برادفورد على قياس التغير في لون صبغات الفثالوسيانين ويتم قياسها كميًا من خلال ملاحظة التفاعل بين البروتينات المختلفة والأصباغ.
المبدأ
اختبار برادفورد هو طريقة قياس البروتين اللوني تعتمد على التغير في امتصاص صبغة الفثالوسيانين الأزرق G-250. يأتي الصبغ بثلاثة أشكال: أنيوني (أزرق)، محايد (أخضر)، وكاتيوني (أحمر). في ظل الظروف الحمضية، يتحول الصبغ الأحمر إلى اللون الأزرق ويرتبط بالبروتين الذي يتم قياسه. إذا لم يكن هناك بروتين للربط، سيبقى المحلول بني اللون.
يرتبط الصبغ بالمجموعات الكربوكسيلية والأمينية للبروتينات من خلال قوى فان دير فالس والتفاعلات المشحونة. أثناء هذه العملية، ينقل الصبغ الأحمر للفثالوسيانين الإلكترونات الحرة إلى السلاسل الجانبية القابلة للتأين للبروتين، مما يؤدي إلى تدمير حالته الأصلية وكشف جيب محب للماء، مما يسمح للصبغة بتعزيز ارتباطها بشكل أكبر من خلال قوى فان دير فالس والتفاعلات الأيونية. الارتباط بـ البروتينات.
المزاياعندما يرتبط الصبغ بالبروتين، يتحول الامتصاص من 465 نانومتر إلى 595 نانومتر، مما يجعل قراءة الامتصاص عند 595 نانومتر مؤشرا على التركيز.
تستطيع طريقة برادفورد تجنب التداخل من العديد من طرق الكشف عن البروتين الأخرى ولديها قدرة تحمل عالية لمواد مثل كبريتات الصوديوم (SDS)، مما يجعل هذه الطريقة قابلة للتطبيق في مجموعة متنوعة من البيئات. لا يمكن قياس العديد من العينات بشكل موثوق في نطاق الامتصاص 280 نانومتر، وتتطلب طريقة برادفورد فقط إضافة الصبغة ثم القياس عند 595 نانومتر.
وهذا يجعل استخدامه بسيطًا مثل خلط العينة مع صبغة الفثالوسيانين الزرقاء في أنبوب اختبار ثم قراءة الامتصاص عند طول موجي 595 نانومتر. تتمكن هذه الطريقة من قياس من 1 إلى 20 ميكروجرام من البروتين وهي حساسة للغاية. لا تستغرق عملية الاختبار عادةً أكثر من 30 دقيقة ويمكن إجراؤها في درجة حرارة الغرفة.
إن بساطة ومرونة اختبار برادفورد تجعله خيارًا سريعًا وموثوقًا به للكشف عن البروتين في مختبرك.
العيوب
على الرغم من أن طريقة برادفورد لها العديد من المزايا، إلا أنها تتمتع بنطاق خطي ضيق نسبيًا وتتطلب التخفيف قبل التحليل، مما قد يؤدي إلى تراكم الأخطاء. بالإضافة إلى ذلك، عندما تحتوي العينة على شروط أساسية معينة أو تركيزات عالية من المنظفات، فقد يتداخل ذلك مع نتائج الاختبار. بالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون هذه الطريقة دقيقة بما يكفي لاكتشاف أنواع معينة من البروتينات، مثل الكولاجين.وهذا يعني أنه عند إجراء اختبار برادفورد، يجب على العلماء أن يكونوا على دراية بتركيبة المواد الكيميائية المستخدمة والآثار المحتملة لها لضمان دقة النتائج.
اتجاه التطوير المستقبلي
مع تقدم البحث العلمي، يستمر اختبار بروتين برادفورد في التطور. ومن بين التعديلات الملحوظة إدخال كمية صغيرة من SDS، مما يزيد من استجابة اكتشاف الكولاجين بمقدار أربعة أضعاف. وفي الوقت نفسه، يؤدي هذا أيضًا إلى تقليل امتصاص البروتينات الأخرى غير الكولاجينية، مما يجعل نتائج الاختبار أكثر دقة.
عملية التشغيل
إجراء التشغيل القياسي لطريقة برادفورد بسيط للغاية. على سبيل المثال، باستخدام بلازما الجلوبيولين البقري الخام كمعيار بروتيني، تكون المعلمات 200-1500 ميكروجرام/مل. في تطبيق الاختبار، كل ما عليك فعله هو تخفيف المحلول القياسي بتركيزات مختلفة، وإضافة صبغة الفثالوسيانين الزرقاء، وتركها لمدة 5 دقائق، وقراءة الامتصاص عند 595 نانومتر، ورسم منحنى قياسي، وحساب تركيز البروتين غير المعروف.
إن إعداد المنحنى القياسي واستخدامه يجعل طريقة برادفورد فعالة ودقيقة في حساب تركيز البروتين.
برز اختبار بروتين برادفورد في مجال البحث العلمي بسبب خصائصه الفريدة والمريحة. ومع تزايد الطلب على التحليل البيئي وتحليل العينات في المستقبل، سيتم تعزيز إمكانية تطبيق هذه الطريقة وأهميتها بشكل أكبر. في هذا العالم العلمي المتغير بسرعة، هل يمكننا أن نجد طرقًا أبسط وأكثر فعالية لكشف أسرار الحياة؟
