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Von 1984 bis heute: Wie der Comet Assay zum Goldstandard für die Beurteilung genetischer Schäden wurde?
Seit seiner Entwicklung durch Östling und Johansson im Jahr 1984 hat sich der Comet-Assay (auch als Einzelzell-Gelelektrophorese, SCGE) zunehmend zu einem wichtigen Instrument zur Beurteilung von DNA-Schäden entwickelt. Diese einfache und sensible Technik wird vor allem zum Nachweis von DNA-Schäden auf der Ebene einzelner eukaryotischer Zellen eingesetzt und findet breite Anwendung in verschiedenen Bereichen, unter anderem bei der Beurteilung von DNA-Schäden/-Reparaturen, im Biomonitoring und bei Tests auf Genotoxizität.
Beim Comet-Assay werden Zellen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt suspendiert, dann unter neutralen oder alkalischen Bedingungen lysiert und die suspendierten lysierten Zellen einer Elektrophorese unterzogen. Die Methode erhielt ihren Namen von dem Kometenmuster, das die DNA bildet, wenn sie durch ein elektrophoretisches Gel wandert.
Grundlegender Ablauf eines Kometenexperiments
1. Schritte zum Einbetten
Zellproben aus In-vitro-Zellkulturen oder von In-vivo-Testpersonen werden in Einzelzellen dispergiert und in bei 37 °C geschmolzener Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt suspendiert. Diese einzelne Suspension wurde dann auf Objektträger verteilt und mithilfe von Deckgläsern aus Glas montiert. Beim Absenken des Deckglases auf den Objektträger verteilt sich die geschmolzene Agarose und bildet eine dünne Schicht. Anschließend wurde die Agarose bei 4 °C eingefroren und das Deckglas entfernt, wodurch eine Kohlenhydratfasermatrix entstand, die die Zellen einkapselte.
2. Lyse-Schritt
Nach dem Entfernen des Deckglases wird der Objektträger in eine Lösung getaucht, die die Zellen lysiert. Häufig verwendete Lyselösungen enthalten hochkonzentrierte Kochsalzlösung und ein Reinigungsmittel wie Triton X-100. Die Funktion dieser Komponenten besteht darin, Zellproteine und Zellmembranen zu zerstören, die DNA-Struktur freizulegen und Nukleosomen mit helikaler DNA zu bilden.
3. Elektrophorese-Schritt
Nach der Lyse werden die Objektträger gewaschen, um sämtliche Salze zu entfernen, und dann in eine zweite Lösung getaucht – die Elektrophoreselösung. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, bewegen sich negativ geladene DNA-Fragmente in Richtung der positiven Elektrode, bis sie gereinigt und mit einem spezifischen Farbstoff markiert werden. Der Intensitätsunterschied zwischen dem Kometenschweif und seinem Kopf lässt sich mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie beobachten und spiegelt die Anzahl der DNA-Brüche wider.
Die Gesamtstruktur ähnelt einem Kometen, wobei sein runder Kopf der in der Höhle verbleibenden unbeschädigten DNA entspricht und der Schweif die Menge der beschädigten DNA darstellt. Je heller und länger der Schweif, desto größer ist das Ausmaß des Schadens.
Anwendungen des Comet-Assays
Der Comet-Test hat ein breites Anwendungsspektrum, darunter Genotoxizitätstests, Human-Biomonitoring und bioepidemiologische Studien. Mithilfe des Comet-Tests stellten die Forscher beispielsweise fest, dass mit zunehmendem Alter die DNA-Schäden in Neuronen und Astrozyten im Gehirn von Mäusen deutlich zunahmen, darunter mehrere Schadensformen wie Einzelstrangbrüche und Doppelstrangbrüche.
Nachweis der DNA-Fragmentierung von Spermien
Mit dem Comet-Test lässt sich auch der Grad der DNA-Fragmentierung in Spermienzellen bestimmen, ein Indikator, der eng mit dem Ergebnis einer In-vitro-Fertilisation zusammenhängt. Bei der Durchführung des Tests wird zusätzlich ein Eingriff zur Zerstörung der Protothecien der Spermien vorgenommen.
Vorteile und Herausforderungen des Comet-Assays
Die Popularität des Comet-Assays wurde durch seine Einfachheit und niedrigen Kosten gesteigert, insbesondere in Umgebungen, in denen komplexere Tests nicht verfügbar sind. Aufgrund ihrer Empfindlichkeit ist diese Technik jedoch auch anfällig gegenüber externen Faktoren, was zu Problemen bei der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse führt. Daher müssen Forscher vorsichtig sein und jegliche Eingriffe vermeiden, die zu DNA-Schäden oder -Denaturierung führen könnten.
„Der Comet-Test ist ein hochempfindliches Instrument zur Feststellung von DNA-Schäden, doch seine effektive Anwendung erfordert umfangreiches Hintergrundwissen und umfangreiche Techniken.“
Zukünftige Forschungsrichtungen
Mit dem Fortschritt der Biotechnologie ist es unvermeidlich, dass sich auch die Technologie und die Anwendungen des Comet-Assays weiterentwickeln. Die Forscher untersuchen, wie sich die Genauigkeit und Empfindlichkeit des Tests weiter verbessern und seine Anwendung auf verschiedene Organismen und Umweltbedingungen ausweiten lässt. Daher ist die Zukunft des Comet-Assays voller Herausforderungen und Chancen.
Der Einsatz dieser Technologie bei der Beurteilung genetischer Schäden, in den Umweltwissenschaften und in der medizinischen Forschung wird zweifellos weiter zunehmen, ebenso wie ein besseres Verständnis für ihre richtige Anwendung und Interpretation der Ergebnisse. Wenn wir in die Zukunft blicken, sollten wir darüber nachdenken, wie wir sicherstellen können, dass diese wichtige Technologie ihr volles Potenzial zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit und zum Schutz der Umwelt entfalten kann.
