Language
Country/Area
No result found
Die Magie des Kometentests: Warum bewegt sich DNA bei der Elektrophorese wie ein Komet?
In der Welt der Wissenschaft war es nie einfach, DNA-Schäden festzustellen. Der Einzelzell-Gelatineelektrophorese-Test (auch als Comet-Test bekannt) bietet jedoch eine einfache und empfindliche Methode zum Nachweis von DNA-Schäden in einzelnen eukaryotischen Zellen. Diese Technik wurde erstmals 1984 von Östling und Johansson entwickelt und 1988 von Singh et al. verbessert. Seitdem ist sie eine der Standardtechniken für DNA-Schäden/-Reparatur, Umweltüberwachung und Mutagenitätstests geworden.
Der Comet-Assay verdankt seinen Namen dem Migrationsmuster der DNA in einem elektrophoretischen Gel, das oft einem Kometen ähnelt.
Das grundlegende Protokoll für diesen Test umfasst das Einkapseln von Zellen in eine Suspension aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, das anschließende Lysieren der Zellen unter neutralen oder alkalischen (pH > 13) Bedingungen und die Elektrophorese der suspendierten lysierten Zellen. Während dieses Prozesses wird die DNA-Struktur der Zelle untersucht. Dabei bilden sich einzigartige „Kometen“-Muster, die das Ausmaß der DNA-Schädigung widerspiegeln.
So funktioniert es
Das Grundprinzip des Comet-Assays besteht darin, dass unbeschädigte DNA eine hochgeordnete Verbindung mit Matrixproteinen im Zellkern beibehält und diese Struktur zerstört wird, wenn die DNA beschädigt wird. Die beschädigten DNA-Stränge verlieren ihre kompakte Struktur, entspannen sich und beginnen, sich in die Agarose hinein auszudehnen. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wird die negativ geladene DNA von der positiv geladenen Anode angezogen, wodurch eine „Kometenform“ entsteht.
Je größer der Schaden ist, desto länger und heller werden die DNA-Schwänze, da mehr DNA-Fragmente aus der Zelle in die Agarose freigesetzt werden können.
Schritte des Comet-Tests
Zelluläre Verkapselung
Zuerst müssen die Forscher Zellen aus In-vitro-Zellkulturen oder In-vivo-Proben gewinnen, diese Zellen dann in Einzelzellen aufteilen und sie in bei 37 °C geschmolzener Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt suspendieren. Diese Einzelzellsuspension wird anschließend auf einen Objektträger aus Glas verteilt und bildet beim Abkühlen eine dünne Schicht Agarose. Der neutrale osmotische Druck der Agarose ermöglicht das Eindringen von Reagenzien, ohne die Position der Zellen zu beeinträchtigen.
Knacken
Anschließend werden die Objektträger in eine Lösung getaucht, die zur Lyse der Zellen führt. Diese Lösung enthält normalerweise hochkonzentriertes Salz und Reinigungsmittel. Salzwasser kann die Proteinstruktur im Inneren von Zellen zerstören und die Zellmembran auflösen. Auf diese Weise bleibt nur die DNA intakt und füllt den Raum aus, der zuvor von der Zelle eingenommen wurde, und bildet eine sogenannte Karyotypstruktur.
Elektrophorese
Sobald die Zellen lysiert sind, werden die Objektträger gewaschen, um überschüssige Salze zu entfernen, und in die Elektrophoreselösung getaucht. Bei der Elektrophorese bewirkt das angelegte elektrische Feld, dass beschädigte DNA sich in Richtung Anode bewegt. Der Grad der Beschädigung beeinflusst dabei direkt die Wanderreichweite der DNA und damit die Form des „Kometen“.
Diese Technologie weist eine äußerst hohe Sensibilität für DNA-Schäden auf und ist daher ein breit gefächertes Erkennungsinstrument.
Anwendungsbereiche
Der Comet-Test wird häufig in den Bereichen Genotoxizitätstests, Human-Biomonitoring, molekulare Epidemiologie und ökogenetische Toxikologie verwendet. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass sich mit dem Comet-Test während der Alterung zahlreiche Arten von DNA-Schäden erkennen lassen, etwa Einzelstrangbrüche und Doppelstrangbrüche. Bei der Diagnose männlicher Unfruchtbarkeit können Forscher den Comet-Test auch verwenden, um den Grad der DNA-Fragmentierung in Spermienzellen zu bestimmen.
Insgesamt bietet der Comet-Test eine effektive und flexible Technik zum Erkennen von DNA-Schäden in Zellen, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Wissenschaft eine einzigartige Rolle spielen kann. Wird es angesichts der fortschreitenden Entwicklung dieser Technologie in Zukunft innovativere Möglichkeiten zur Erkennung und Reparatur von DNA-Schäden geben, sodass die menschliche Gesundheit neue Meilensteine erreichen kann?
