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Next Generation Sequencing Revolution: Was macht Massive Parallel Sequencing so leistungsstark?
Im Bereich der biomedizinischen Wissenschaften verändert die rasante Entwicklung der DNA-Sequenzierungstechnologie ständig unser Verständnis des Genoms. Massive Parallel Sequencing, auch bekannt als Next-Generation Sequencing (NGS), ist eine der Kerntechnologien dieses Wandels.
Massive Parallel Sequencing ermöglicht uns die Generierung von 1 Million bis 43 Milliarden Short-Sequence-Reads in einem einzigen Gerätedurchlauf, was in der Vergangenheit unvorstellbar war.
Von 1993 bis 1998 wurden mehrere Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungstechnologien entwickelt und nach 2005 kommerzialisiert. Diese Techniken nutzen miniaturisierte und parallelisierte Plattformen, wodurch große Mengen an DNA-Sequenzdaten pro Lauf erfasst werden können. Im Vergleich zur herkömmlichen Sanger-Sequenzierung kann Massive Parallel Sequencing die Sequenzierung in größerem Maßstab durchführen und ist nicht mehr auf unabhängige Sequenzierungsreaktionen angewiesen.
Betriebsprozess der NGS-Plattform
Bei kommerziell erhältlichen NGS-Plattformen umfasst der grundlegende Prozess der DNA-Sequenzierung normalerweise die folgenden Schritte. Erstens werden DNA-Sequenzierungsbibliotheken durch klonale In-vitro-PCR-Amplifikation erstellt; zweitens erfolgt die Sequenzbestimmung durch Synthese und schließlich werden diese räumlich getrennten amplifizierten DNA-Vorlagen parallel sequenziert, ohne dass physische Trennungsschritte erforderlich sind. Dieses parallelisierte Reaktionsmodell ermöglicht die Generierung von Hunderten Billionen bis Milliarden Nukleotidsequenzen pro Lauf, was die verfügbaren Sequenzdaten erheblich bereichert.
Massive Parallel Sequencing sorgt nicht nur für eine höhere Datenausgabe, sondern reduziert auch die Sequenzierungskosten erheblich, die mittlerweile bei fast 1.000 US-Dollar pro Genom liegen.
Vorlagenvorbereitungsmethode
Zur Vorbereitung von Templates in NGS-Reaktionen werden zwei Methoden verwendet: Eine ist die Amplifikations-Template aus einem einzelnen DNA-Molekül und die andere nutzt direkt ein einzelnes DNA-Molekül-Template.
Creme-PCR-Methode
Bei der Creme-PCR-Methode wird zunächst eine DNA-Bibliothek erstellt, und dann werden einzelsträngige DNA-Fragmente an die Oberfläche von Perlen gebunden, die in Wasser-Öl-Cremepartikeln eingekapselt werden, um einen PCR-Mikroreaktor zur Amplifikation einer einzelnen DNA-Matrize zu bilden.
Brückenverstärkungsmethode
Die Brückenamplifikation wird durch kovalente Anbringung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern an der Oberfläche der Durchflusszelle erreicht. Diese Technologie wird häufig verwendet, um hochdichte Template-Cluster für NGS zu erstellen, die für nachfolgende Sequenzierungsreaktionen geeignet sind.
Sequenzierungsmethode
Es gibt mehrere Hauptmethoden zur NGS-Sequenzierung, darunter Sequenzierung durch Synthese, Pyrosequenzierung und Sequenzierung durch reversible Terminatorchemie.
Das Prinzip der synthetischen Sequenzierung beruht auf dem Endonukleosidverdau der DNA-Polymerase und bestimmt die Sequenz der Probe durch den Nachweis des Einbaus jedes Nukleotids. Diese Technologie wurde von fast allen parallelen Sequenzierungsinstrumenten übernommen.
Die Flammensequenzierung kombiniert feste Trägermaterialien und konstruierte DNA-Polymerasen, um jede Nukleotid-Addition durch sofortige Lumineszenz zu erkennen. Die Entwicklung dieser Technologien hat die DNA-Sequenzierung schneller, genauer und effizienter gemacht.
Zukünftige Trends und Herausforderungen
Da die Technologie weiter voranschreitet, sinken die Kosten für NGS weiter und ihr Anwendungsbereich wird immer größer. Allerdings steht die Technologie immer noch vor einigen Herausforderungen, darunter der hohen Abhängigkeit von Instrumenten und der Komplexität der Datenanalyse. Zukünftige Forschung könnte sich darauf konzentrieren, wie die Lesegenauigkeit und -geschwindigkeit weiter verbessert und der Datenanalyseprozess vereinfacht werden kann.
Wie wird Massive Parallel Sequencing unser Verständnis der Biowissenschaften in der zukünftigen Genomforschung weiter vorantreiben?
Wie wird sich das Potenzial der Massive Parallel Sequencing in dieser Revolution der Genomik auf unsere Zukunft auswirken?
