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Die Vergangenheit der Sanger -Sequenzierung und die Zukunft von NGS: Wie geht die DNA -Sequenzierung von Single zu Parallel?
Auf dem Gebiet der biomedizinischen Wissenschaft hat die DNA -Sequenzierungstechnologie signifikante Veränderungen erfahren.Seit der Einführung der Sanger-Sequenzierung wurde das Geheimnis des Genoms für uns enthüllt, und die Entstehung der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) hat diese Technologie auf neue Höhen gebracht.Dieser technologische Sprung von Single zu parallel erhöht nicht nur die Geschwindigkeit der Sequenzierung, sondern reduziert auch die Kosten der Sequenzierung und verändert so die Forschungslandschaft der Genomik.
Die Entstehung von NGs ermöglicht es uns, in kurzer Zeit zig Millionen genomischer Daten zu erhalten, was für die Sanger -Sequenzierung unvergleichlich ist.
ngs bezieht sich auf verschiedene Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungsmethoden, die das Konzept der großflächigen parallele Verarbeitung verwenden.Viele dieser Technologien entstanden nacheinander von 1993 bis 1998 und wurden 2005 kommerzialisiert.Diese Technologien ermöglichen es jedem Instrument, beim Lauf von 1 Million auf 43 Milliarden kurze Sequenz -Lesevorgänge zu generieren.In diesen Plattformen unterscheiden sich die technische Konfigurationen und die Sequenzierungschemie, haben jedoch ein gemeinsames technisches Paradigma: eine großflächige parallele Sequenzierung durch räumlich isolierte, klonal amplifizierte DNA-Template oder einzelne DNA-Moleküle.
Gleichzeitig wird die Sanger-Sequenzierung auch als Sequenzierung der ersten Generation bezeichnet, die sich auf die Elektrophorese stützt, um die Endprodukte zu trennen.Obwohl diese Methode eine lange Geschichte hat, erscheint sie skrupellos, wenn sie sich den aktuellen wissenschaftlichen Bedürfnissen erfüllen.Die NGS-Methodik ermöglicht es uns, eine groß angelegte Sequenzierungsarbeit gleichzeitig zu vervollständigen, wodurch die genetische Forschung beispiellose Effizienz und Genauigkeit verleiht.
ngs Plattform
Der Prozess der DNA -Sequenzierung unter Verwendung von kommerziell erhältlichen NGS -Plattformen ist normalerweise in mehrere Schritte unterteilt:
- DNA -Sequenzierungsbibliotheken wurden durch in vitro -PCR -klonale Amplifikation erzeugt.
- DNA -Sequenz wird durch synthetische Sequenzierung bestimmt, basierend auf der Erhöhung von Nukleotiden am komplementären Strang.
- räumlich isolierte, amplifizierte DNA-Vorlagen werden gleichzeitig in groß angelegter Weise parallel sequenziert, ohne dass physikalische Trennschritte erforderlich sind.
Obwohl diese Schritte auf den meisten NGS -Plattformen ähnlich sind, variieren die Strategien jeder Plattform, wodurch jede Technologie und Anwendungsbereiche auf dem Markt einzigartig sind.
Die parallelisierte Sequenzierungsreaktion von NGs kann Hunderte von Mega -zu -Gigabit -Nukleotidsequenz in einem einzigen Instrumentenlauf erzeugen.Diese Änderung erhöhte die Menge an verfügbaren Sequenzdaten erheblich, was zu grundlegenden Veränderungen in den Genomsequenzierungsmethoden der Medizinerschaft führte.Mit der Entstehung neu auftretender NGS -Technologien und -Instrumente wurden auch die Sequenzkosten erheblich reduziert, was dem Standard von nur 1.000 USD pro Genom näherte.
Vorlagevorbereitungsmethode
Bei der Durchführung von NGS -Reaktionen gibt es zwei Hauptmethoden zum Herstellen von Vorlagen: Amplifikationsvorlagen aus einem einzelnen DNA -Molekül und einer einzelnen DNA -Molekül -Vorlage.
Für Bildgebungssysteme, die kein einzelnes fluoreszierendes Ereignis erkennen können, muss die DNA -Vorlage verstärkt werden.Zu den gängigen Verstärkungsmethoden gehören Emulsions -PCR, Rollringverstärkung und feste Phasenverstärkung.
Lotion PCR
In der Emulsions-PCR-Methode wird zuerst eine DNA-Bibliothek durch zufällige Fragmentierung der genomischen DNA erzeugt, und dann ist das einzelne DNA-Fragment mit dem Linker mit der Oberfläche des Partikels verbunden. repräsentiert ein DNA -Fragment.Die Partikel werden dann in Wasserölemulsionstropfen verpackt, von denen jedes ein PCR-Mikroreaktor ist, bei dem eine amplifizierte Einzel-DNA-Vorlagenkopie erzeugt wird.
Brückenverstärkung
Bei der Brückenverstärkung sind die Vorwärts- und Rückwärtsprimer bei hoher Dichte kovalent am Substrat der Durchflusszelle gebunden.Nachdem das enzymatisch erweiterte Reagenz ausgesetzt ist, erstreckt sich die gepaarte Vorlage über die Oberflächenprimer, wodurch letztendlich die lokale Amplifikation von DNA -Polymeren an Millionen verschiedener Orte abgeschlossen ist und zu einem unabhängigen Vorlagecluster wird.
Einzelmolekularvorlage
Die Herstellung von Einzelmolekül-Vorlagen ist im Vergleich intuitiver, für die kein PCR-Schritt erforderlich ist.Im Allgemeinen werden Einzelmolekularvorlagen auf fester Unterstützung festgelegt und auf unterschiedliche Weise verstärkt.Wie beim ersten Ansatz werden die räumlich verteilten Primer gegenüber der festen Unterstützung immobilisiert, und die zufällig gespaltenen DNA -Fragmente werden dann mit den immobilisierten Primern hybridisiert.
Sequenzierungsmethode
Die Sequenzierungsmethoden von NGs haben ihre eigenen Eigenschaften, einschließlich synthetischer Sequenzierung, Pyrosequenzierung und reversibler Terminatorchemie.Der Zweck der synthetischen Sequenzierung besteht darin, die Sequenz der Probe durch Nachweis der Zugabe von Nukleotiden der DNA -Polymerase zu bestimmen.
kann NGS nach dem Verlust der mühsamen Schritte für die traditionelle Sanger -Sequenzierung ein effizienteres Paradigma für die genomische Forschung darstellen.
Während sich die Technologie entwickelt, haben wir den Übergang der DNA-Sequenzierung von einer frühen Single-Sequenz-Methode zum heutigen parallelen Verarbeitungsmodell erlebt, das nicht nur die Effizienz verbessert, sondern auch beispiellose Vorteile von Kosten und Zeit hat.In welche Richtung wird sich die zukünftige DNA -Sequenzierungstechnologie entwickeln?
