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Dynamische Prozesse in Zellen sehen: Wie hilft uns die Fluoreszenzbildgebung, die Genexpression zu verstehen?
Die Fluoreszenzbildgebung ist eine nicht-invasive Bildgebungstechnik, die uns hilft, biologische Prozesse in lebenden Organismen zu visualisieren. Bei dieser Technik kommen verschiedene Methoden zum Einsatz, darunter Mikroskopie, bildgebende Verfahren und Spektroskopie zur Bilderzeugung. Fluoreszenz ist im Wesentlichen ein Lumineszenzphänomen, das auftritt, wenn eine Substanz elektromagnetische Strahlung absorbiert und dann Licht einer bestimmten Wellenlänge freisetzt. Moleküle, die Licht aussenden können, werden Fluorophore genannt. Bei der Fluoreszenzbildgebung werden fluoreszierende Farbstoffe und fluoreszierende Proteine verwendet, um molekulare Mechanismen und Strukturen zu markieren und so die experimentelle Beobachtung der dynamischen Prozesse der Genexpression, Proteinexpression und molekularen Interaktionen zu ermöglichen.
Die Fluoreszenzbildgebung bietet ein präzises quantitatives Werkzeug für biochemische Anwendungen.
Es besteht häufig ein Missverständnis zwischen Fluoreszenz und Biolumineszenz. Der Unterschied zwischen beiden liegt in dem Proteinprozess, der das Licht erzeugt. Biolumineszenz ist ein chemischer Prozess, bei dem Enzyme Substrate zerlegen, um Licht zu erzeugen, während Fluoreszenz die physikalische Anregung von Elektronen und ihre anschließende Rückkehr in den Grundzustand zur Freisetzung von Licht ist.
Fluoreszenzmechanismus
Wenn ein Molekül Licht absorbiert, steigt die Energie des Moleküls kurzzeitig in einen angeregteren Zustand. Wenn es anschließend in seinen Grundzustand zurückkehrt, sendet es Fluoreszenzlicht aus, das erkannt und gemessen werden kann. Die konkrete Wellenlänge des emittierten Lichts hängt von der Energie der absorbierten Photonen ab, daher muss diese Wellenlänge im Experiment vorab bekannt sein, damit das Messgerät die Lichterzeugung korrekt erkennen kann.
Die Formel zur Bestimmung der Fluoreszenzemissionswellenlänge lautet: λ-Emission = hc / Energieemission
Hier ist h die Plancksche Konstante und c die Lichtgeschwindigkeit. Normalerweise wird ein großes Scangerät oder CCD verwendet, um die Intensität zu messen und das Bild zu digitalisieren.
Fluoreszierende Farbstoffe und Proteine
Fluoreszierende Farbstoffe haben eine höhere Photostabilität und Helligkeit und benötigen im Vergleich zu fluoreszierenden Proteinen keine Reifezeit. In Bezug auf die Helligkeit hängen der Extinktionskoeffizient (die Fähigkeit, Licht zu absorbieren) und die Quanteneffizienz (wie gut absorbiertes Licht in Fluoreszenzlicht umgewandelt wird) eines Fluorophors eng zusammen. Der Farbstoff selbst ist nicht stark fluoreszierend, wird aber leichter erkennbar, wenn er an ein Protein gebunden ist. Beispielsweise kann NanoOrange an die Beschichtung und die hydrophoben Bereiche von Proteinen binden und wird durch Reduktionsmittel nicht beeinträchtigt.
Proteine können autofluoreszieren, wenn sie einfallendes Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbieren. Beispielsweise sendet das grün fluoreszierende Protein (GFP) grünes Licht aus, wenn es Licht im blauen bis ultravioletten Bereich ausgesetzt wird. Fluoreszierende Proteine sind hervorragende Reportermoleküle, die dabei helfen, Proteine zu lokalisieren, die Proteinbindung zu beobachten und die Genexpression zu quantifizieren.
Bildgebungsbereich
Da einige Fluoreszenzwellenlängen außerhalb des Bereichs des menschlichen Auges liegen, wird CCD verwendet, um das Licht genau zu erfassen und ein Bild zu erzeugen. Dies geschieht normalerweise im Bereich von 300–800 nm. Ein Vorteil von Fluoreszenzsignalen besteht darin, dass die Beziehung zwischen der Intensität des emittierten Lichts und der Anzahl der vorhandenen fluoreszierenden Moleküle im Allgemeinen linear ist. Dies erfordert im Wesentlichen, dass die einfallende Lichtintensität und Wellenlänge konstant bleiben. Das endgültige Bild wird normalerweise im 12-Bit- oder 16-Bit-Datenformat gerendert.
Bildgebungssystem
Zu den Hauptkomponenten eines Fluoreszenzbildgebungssystems gehören: eine Anregungsquelle (die breitwelliges Licht oder Laserlicht erzeugen kann), eine Lichtanzeigeoptik (zur Beleuchtung der Probe) und eine Lichtsammeloptik (normalerweise bestehend aus Linsen, Spiegeln und Filtern). ). und Geräte zur Erkennung, Verstärkung und Visualisierung (wie etwa Photomultiplier-Röhren oder CCDs).Anwendungen
Die Fluoreszenzbildgebung wird in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen häufig eingesetzt, darunter:
- SYBR Green ist ein gängiger Farbstoff zur Visualisierung von DNA-Banden bei der PCR (Agarose-Gelelektrophorese).
- Verwenden Sie Fluoreszenzbildgebung zur Unterstützung der Navigation bei Transplantationen. Beispielsweise kann die Krickente bei Krebspatienten zur Lymphknotenerkennung eingesetzt werden.
- Bei der Kalziumbildgebung werden fluoreszierende Moleküle verwendet, um die Aktivität lebender Zellen im Nervensystem zu überwachen.
Vorteile und Nachteile
Obwohl die Fluoreszenzbildgebung einige Vorteile bietet, wie etwa den nicht-invasiven Betrieb und die hohe Empfindlichkeit, bringt sie auch einige Herausforderungen mit sich, wie etwa Fluoreszenzbleiche, Umweltempfindlichkeit und begrenztes Auflösungsvermögen.Zukünftige Richtungen
Wissenschaftler arbeiten an der Entwicklung effizienterer fluoreszierender Proteine, um die Leistung von Bildgebungssonden zu verbessern. Durch Methoden wie Gentechnik und Umweltstabilisierung dürfte die Fluoreszenzbildgebungstechnologie der Zukunft Durchbrüche in mehreren Dimensionen erzielen.
Die Fluoreszenzbildgebung bietet zahlreiche Möglichkeiten, die Vorgänge im Zellinneren zu erforschen. Welche neuen biologischen Phänomene könnten also durch künftige Entdeckungen ans Licht kommen?
