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Die erstaunlichen Einsatzmöglichkeiten der FLIM-Mikroskopie: Wie erhält man Bilder mit ultrahoher Auflösung bei der Echtzeiterkennung?
Mit der rasanten Entwicklung von Wissenschaft und Technik wird heute auch die Mikroskoptechnologie ständig weiterentwickelt. Unter anderem ist die Fluoreszenzlebensdauer-Bildmikroskopie (FLIM) mit ihren einzigartigen Bildgebungsprinzipien und praktischen Anwendungen zu einem wichtigen Werkzeug in den Biowissenschaften und der Materialforschung geworden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Mikroskopen, die die Fluoreszenzintensität als Grundlage für die Bildgebung verwenden, erzeugt FLIM Bilder basierend auf der Geschwindigkeit der Rückkehr fluoreszierender Moleküle vom angeregten Zustand in den Grundzustand und nicht auf der Intensität.
Durch die Messung der Fluoreszenzlebensdauer eliminiert FLIM nicht nur Messfehler, die durch Änderungen der Helligkeit der Lichtquelle, der Intensität des Hintergrundlichts oder Photobleichung verursacht werden, sondern minimiert auch die Auswirkungen der Photonenstreuung in dickeren Schichten der Probe.
„Die Änderung der Fluoreszenzlebensdauer hängt von der lokalen Mikroumgebung des fluoreszierenden Moleküls ab und kann daher als Indikator für pH-Wert, Viskosität, Konzentration chemischer Substanzen usw. verwendet werden.“
Grundprinzipien der Fluoreszenzlebensdauer
Wenn Photonenmoleküle durch Photonen angeregt werden, kehren sie mit unterschiedlicher Wahrscheinlichkeit über elektromagnetische Strahlung und nichtstrahlende Dämpfungswege in den Grundzustand zurück. Unter ihnen ist nur der Weg, der spontan Photonen emittiert, mit der Bildung von Fluoreszenz konfrontiert. Gemäß dem Gesetz von Schott kann der mathematische Ausdruck des zeitlichen Abfalls der Fluoreszenzintensität auf eine Exponentialfunktion vereinfacht werden. Dies zeigt, dass die Fluoreszenzlebensdauer eine physikalische Größe ist, die unabhängig von der Anfangsintensität ist.
FLIM-Mess- und Implementierungstechnologie
Bei FLIM kann das Instrument eine Impulsanregungsquelle verwenden und dann eine Abklingkurve basierend auf der Reaktionsfunktion der Maschine aufzeichnen. Wenn eine Gruppe fluoreszierender Moleküle durch ultrakurze Lichtimpulse angeregt wird, nimmt die erzeugte zeitaufgelöste Fluoreszenz zwangsläufig exponentiell ab. Die gebräuchlichste Implementierung basiert auf der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC), die die Messgenauigkeit verbessert und die Auswirkungen von Hintergrundrauschen minimiert.
„Mit kommerziellen TCSPC-Geräten kann die Zeitauflösung der Fluoreszenz-Abklingkurve 405 Femtosekunden erreichen.“
Anwendungsbereich
Die FLIM-Technologie bietet einzigartige Vorteile bei der Untersuchung lebender Zellen und ihrer Mikroumgebungskonzepte. Diese Technologie kann verschiedene molekulare Bewegungen auf Nanometerebene unterscheiden und kann zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen, Veränderungen der intrazellulären Enzymaktivität usw. verwendet werden.
In den letzten Jahren wurde die FLIM-Technologie weiter in der medizinischen Diagnose eingesetzt, insbesondere bei Hirntumoroperationen, und kann mit der Endoskopie kombiniert werden, um eine Echtzeitdiagnose durchzuführen. Durch die Messung der Fluoreszenzlebensdauer von Tumorgewebe können Ärzte die Grenzen und Eigenschaften von Tumoren genauer beurteilen.
Datenanalyse und Zukunftsaussichten
Bei der FLIM-Bildanalyse sind die Extraktion reiner Schwächungskurven und die Schätzung der Fluoreszenzlebensdauer zentrale Aufgaben. In diesem Zusammenhang wurden verschiedene Algorithmen vorgeschlagen, sei es die Methode der kleinsten Quadrate oder die Methode zur schnellen Bestimmung der Lebensdauer, die alle die Genauigkeit und Praktikabilität der Berechnungen ständig verbessern.
„Die Entwicklung dieser Methoden hat FLIM von einer Labortheorie zu einem praktischeren und bequemeren Verfahren gemacht, sodass diese Technologie Eingang in die klinische Praxis finden kann.“
Mit der Weiterentwicklung der Technologie wird die Bilderfassungsgeschwindigkeit von FLIM weiter zunehmen und sein Anwendungsbereich wird breiter. Ob in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung oder in der klinischen Diagnose, das Potenzial dieser Technologie ist nicht zu übersehen. Da sich jedoch die Anwendungsfelder erweitern, müssen wir darüber nachdenken, wie wir die FLIM-Technologie besser mit anderen Techniken kombinieren können, um die Entwicklung und Innovation der Biomedizin zu fördern.
