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Revolución de la secuenciación de próxima generación: ¿Qué hace que la secuenciación paralela masiva sea tan poderosa?
En el campo de las ciencias biomédicas, el rápido desarrollo de la tecnología de secuenciación del ADN está cambiando constantemente nuestra comprensión del genoma. La secuenciación masiva en paralelo, también conocida como secuenciación de próxima generación (NGS), es una de las tecnologías centrales de este cambio.
La secuenciación paralela masiva nos permite generar de 1 millón a 43 mil millones de lecturas de secuencias cortas en una sola ejecución de dispositivo, algo que era inimaginable en el pasado.
De 1993 a 1998, se desarrollaron y comercializaron varias tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento después de 2005. Estas técnicas aprovechan plataformas miniaturizadas y paralelizadas, lo que permite obtener grandes cantidades de datos de secuencias de ADN por ejecución. En comparación con la secuenciación tradicional de Sanger, la secuenciación masiva paralela puede completar la secuenciación a mayor escala y ya no depende de reacciones de secuenciación independientes.
Proceso de operación de la plataforma NGS
Para las plataformas NGS disponibles comercialmente, el proceso básico de secuenciación de ADN suele incluir los siguientes pasos. En primer lugar, las bibliotecas de secuenciación de ADN se generan mediante amplificación clonal por PCR in vitro; en segundo lugar, la determinación de la secuencia se realiza mediante síntesis y, finalmente, estas plantillas de ADN amplificadas espacialmente separadas se secuencian en paralelo sin necesidad de pasos de separación física; Este modelo de reacción paralelizada permite la generación de cientos de billones a miles de millones de secuencias de nucleótidos por ejecución, lo que enriquece enormemente los datos de secuencias disponibles.
La secuenciación masiva en paralelo no solo proporciona una mayor producción de datos, sino que también reduce significativamente los costos de secuenciación, que ahora se acercan a los 1.000 dólares estadounidenses por genoma.
Método de preparación de la plantilla
Se utilizan dos métodos para preparar plantillas en reacciones NGS, uno es la plantilla de amplificación a partir de una única molécula de ADN y el otro utiliza una única plantilla de molécula de ADN directamente.
Método PCR en crema
En el método de PCR en crema, primero se genera una biblioteca de ADN y luego se unen fragmentos de ADN monocatenario a la superficie de las perlas, que se encapsulan dentro de partículas de crema de agua y aceite para formar un microrreactor de PCR para amplificar una única plantilla de ADN.
Método de amplificación del puente
La amplificación del puente se logra uniendo covalentemente cebadores directos e inversos a la superficie de la celda de flujo. Esta tecnología se utiliza ampliamente para crear grupos de plantillas de alta densidad para NGS, adecuados para reacciones de secuenciación posteriores.
Método de secuenciación
Existen varios métodos principales de secuenciación NGS, incluida la secuenciación por síntesis, pirosecuenciación y secuenciación mediante química de terminador reversible.
El principio de la secuenciación sintética se basa en la digestión endonucleósida de la ADN polimerasa y determina la secuencia de la muestra detectando la incorporación de cada nucleótido. Esta tecnología ha sido adoptada por casi todos los instrumentos de secuenciación paralela.
La secuenciación con llama combina materiales de soporte sólidos y ADN polimerasas diseñadas para detectar cada adición de nucleótidos mediante luminiscencia instantánea. El desarrollo de estas tecnologías ha hecho que la secuenciación de ADN sea más rápida, precisa y eficiente.
Tendencias y desafíos futuros
A medida que la tecnología continúa avanzando, el costo de NGS continúa disminuyendo y su rango de aplicaciones se vuelve cada vez más amplio. Sin embargo, la tecnología aún enfrenta algunos desafíos, incluida la alta dependencia de los instrumentos y la complejidad del análisis de datos. Las investigaciones futuras pueden centrarse en cómo mejorar aún más la precisión y la velocidad de lectura, y cómo simplificar el proceso de análisis de datos.
¿Cómo avanzará la secuenciación masiva en paralelo nuestra comprensión de las ciencias biológicas en futuras investigaciones genómicas?
En esta revolución genómica, ¿cómo afectará nuestro futuro el potencial de la secuenciación paralela masiva?
