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El pasado de la secuenciación de Sanger y el futuro de NGS: ¿Cómo va de la secuenciación de ADN de sencillo a paralelo?
En el campo de la ciencia biomédica, la tecnología de secuenciación de ADN ha sufrido cambios significativos.Desde la introducción de la secuenciación de Sanger, el misterio del genoma se ha presentado para nosotros, y la aparición de la secuenciación de próxima generación (NGS) ha llevado esta tecnología a nuevas alturas.Este salto tecnológico de sencillo a paralelo no solo aumenta la velocidad de secuenciación, sino que también reduce el costo de la secuenciación, cambiando así el panorama de la investigación de la genómica.
La aparición de NGS nos permite obtener decenas de millones de datos genómicos en un corto período de tiempo, lo cual es incomparable a la secuenciación de Sanger.
NGS se refiere a varios métodos de secuenciación de ADN de alto rendimiento que utilizan el concepto de procesamiento paralelo a gran escala.Muchas de estas tecnologías surgieron una tras otra de 1993 a 1998 y se comercializaron en 2005.Estas tecnologías permiten que cada instrumento genere de 1 millón a 43 mil millones de lecturas de secuencia corta cuando se ejecuta.En estas plataformas, las configuraciones técnicas y la química de secuenciación difieren, pero comparten un paradigma técnico común: la secuenciación paralela a gran escala a través de plantillas de ADN de amplitud clonada espacialmente aislada o moléculas de ADN individuales.
Al mismo tiempo, la secuenciación de Sanger también se conoce como secuenciación de primera generación, que se basa en la electroforesis para separar los productos finales.Aunque este método tiene una larga historia, parece inescrupuloso cuando se enfrenta a las necesidades científicas actuales.La metodología NGS nos permite completar el trabajo de secuenciación a gran escala al mismo tiempo, aportando eficiencia y precisión sin precedentes a la investigación genética.
PlataformaNGS
El proceso de secuenciación de ADN utilizando plataformas NGS disponibles comercialmente generalmente se divide en varios pasos:
- Las bibliotecas de secuenciación de ADN se generaron mediante amplificación clonal de PCR in vitro. La secuencia de ADN
- se determina mediante secuenciación sintética basada en el aumento de nucleótidos en la cadena complementaria.
- Las plantillas de ADN amplificadas espacialmente aisladas se secuencian simultáneamente de manera paralela a gran escala, sin la necesidad de pasos de separación física.
Aunque estos pasos son similares en la mayoría de las plataformas NGS, las estrategias de cada plataforma varían, lo que hace que cada tecnología sea única y áreas de aplicación en el mercado.
La reacción de secuenciación paralelizada de NGS puede generar cientos de mega a la secuencia de nucleótidos de gigabit lecturas en una sola ejecución del instrumento.Este cambio aumentó en gran medida la cantidad de datos de secuencia disponibles, lo que resultó en cambios fundamentales en los métodos de secuenciación del genoma de la ciencia médica.Con la aparición de tecnologías e instrumentos NGS emergentes, el costo de la secuenciación también se ha reducido significativamente, abordando el estándar de solo $ 1,000 por genoma.
Método de preparación de plantillas
Al realizar reacciones NGS, hay dos métodos principales para preparar plantillas: plantillas de amplificación de una sola molécula de ADN y una sola plantilla de molécula de ADN.
Para sistemas de imágenes que no pueden detectar un solo evento fluorescente, la plantilla de ADN debe amplificarse.Los métodos de amplificación comunes incluyen PCR de emulsión, amplificación del anillo de rodadura y amplificación de fase sólida.
PCR de loción
En el método de PCR de emulsión, una biblioteca de ADN se genera primero por fragmentación aleatoria del ADN genómico, y luego el fragmento de ADN monocatenario está conectado a la superficie de la partícula con el enlazador. representa un fragmento de ADN.Las partículas se empaquetan en gotas de emulsión de aceite de agua, cada una de las cuales es un microrreactor de PCR, donde se produce una copia de plantilla de ADN simple amplificada.
Amplificación del puente
En la amplificación del puente, los cebadores hacia adelante e inverso se unen covalentemente al sustrato de la celda de flujo a alta densidad.Después de que se expone el reactivo enzimáticamente extendido, la plantilla emparejada se extiende sobre los cebadores superficiales, completando en última instancia la amplificación local de polímeros de ADN en millones de ubicaciones diferentes, convirtiéndose en un grupo de plantilla independiente.
plantilla de un solo molecular
La preparación de plantillas de una sola molécula es más intuitiva en comparación, lo que no requiere un paso de PCR.En general, las plantillas moleculares individuales se fijan en soporte sólido y se amplifican de diferentes maneras.Como en el primer enfoque, los cebadores distribuidos espacialmente se inmovilizan en el soporte sólido, y los fragmentos de ADN escindidos al azar se hibridan a los cebadores inmovilizados.
Método de secuenciación
Los métodos de secuenciación de los NG tienen sus propias características, incluida la secuenciación sintética, la pirosequenciación y la química de terminador reversible.El propósito de la secuenciación sintética es determinar la secuencia de la muestra detectando la adición de nucleótidos de la ADN polimerasa.
Podría decirse que, después de perder los tediosos pasos requeridos para la secuenciación tradicional de Sanger, NGS proporciona un paradigma más eficiente para la investigación genómica.
A medida que se desarrolla la tecnología, hemos sido testigos de la transición de la secuenciación de ADN de un método temprano de secuencia única al modelo de procesamiento paralelo de hoy, que no solo mejora en gran medida la eficiencia, sino que también ofrece ventajas sin precedentes en el costo y el tiempo.¿En qué dirección se desarrollará la tecnología de secuenciación de ADN futura?
