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Ver procesos dinámicos en las células: ¿cómo nos ayudan las imágenes de fluorescencia a comprender la expresión genética?
La obtención de imágenes por fluorescencia es una técnica de imágenes no invasiva que nos ayuda a visualizar los procesos biológicos que ocurren en los organismos vivos. Esta técnica utiliza una variedad de métodos que incluyen microscopía, sondas de imágenes y espectroscopia para generar imágenes. La fluorescencia es esencialmente un fenómeno de luminiscencia que ocurre cuando una sustancia absorbe radiación electromagnética y luego libera luz de una longitud de onda específica. Las moléculas que pueden emitir luz se llaman fluoróforos. Las imágenes de fluorescencia utilizan colorantes fluorescentes y proteínas fluorescentes para marcar la maquinaria y las estructuras moleculares, lo que permite la observación experimental de los procesos dinámicos de expresión genética, expresión proteica e interacciones moleculares.
La obtención de imágenes de fluorescencia proporciona una herramienta cuantitativa precisa para aplicaciones bioquímicas.
A menudo existe un malentendido entre fluorescencia y bioluminiscencia, la diferencia entre ambas es el proceso proteico que produce la luz. La bioluminiscencia es un proceso químico que implica enzimas que descomponen sustratos para producir luz, mientras que la fluorescencia es la excitación física de los electrones seguida de su regreso al estado fundamental para liberar luz.
Mecanismo de fluorescencia
Cuando una molécula absorbe luz, la energía de la molécula aumenta brevemente a un estado más excitado. Cuando posteriormente regresa a su estado fundamental, emite luz fluorescente, que puede detectarse y medirse. La longitud de onda específica de la luz emitida depende de la energía de los fotones absorbidos, por lo que esta longitud de onda debe conocerse de antemano en el experimento para que el equipo de medición pueda detectar correctamente la generación de luz.
La fórmula para determinar la longitud de onda de emisión de fluorescencia es: λ emisión = hc / Energía de emisión
Aquí, h es la constante de Planck y c es la velocidad de la luz. Normalmente, se utiliza un dispositivo de escaneo grande o CCD para medir la intensidad y digitalizar la imagen.
Colorantes y proteínas fluorescentes
Los colorantes fluorescentes tienen mayor fotoestabilidad y brillo y no requieren tiempo de maduración en comparación con las proteínas fluorescentes. En términos de brillo, el coeficiente de extinción (la capacidad de absorber luz) y la eficiencia cuántica (qué tan bien convierte la luz absorbida en luz fluorescente) de un fluoróforo están estrechamente relacionados. El tinte en sí no es muy fluorescente, pero cuando se une a una proteína, se vuelve más detectable. Por ejemplo, NanoOrange puede unirse al recubrimiento y a las regiones hidrofóbicas de las proteínas y no se ve afectado por los agentes reductores.
Las proteínas pueden autofluorescer cuando absorben luz incidente de una longitud de onda específica. Por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP) emite luz verde cuando se expone a la luz en el rango azul a ultravioleta. Las proteínas fluorescentes son excelentes moléculas indicadoras que ayudan a localizar proteínas, observar la unión de proteínas y cuantificar la expresión genética.
Rango de imagen
Dado que algunas longitudes de onda de fluorescencia están más allá del alcance del ojo humano, se utiliza CCD para detectar la luz con precisión y formar una imagen. Esto normalmente se hace en el rango de 300 a 800 nm. Una ventaja de las señales de fluorescencia es que la relación entre la intensidad de la luz emitida y el número de moléculas fluorescentes presentes es generalmente lineal, lo que requiere esencialmente que la intensidad de la luz incidente y la longitud de onda permanezcan constantes. La imagen final normalmente se representa en formato de datos de 12 o 16 bits.
Sistema de imágenes
Los componentes principales de un sistema de imágenes de fluorescencia incluyen: una fuente de excitación (que puede producir luz de longitud de onda amplia o luz láser), una óptica de visualización de luz (usada para iluminar la muestra) y una óptica de recolección de luz (generalmente compuesta de lentes, espejos y filtros). ), y dispositivos de detección, amplificación y visualización (como tubos fotomultiplicadores o CCD).Aplicaciones
La obtención de imágenes por fluorescencia se ha utilizado ampliamente en diferentes campos científicos, entre ellos:
- SYBR Green es un colorante común utilizado para visualizar bandas de ADN en PCR (electroforesis en gel de agarosa). Utilice imágenes de fluorescencia para facilitar la navegación en el trasplante. Por ejemplo, la cerceta india se puede utilizar en pacientes con cáncer para detectar ganglios linfáticos. En la obtención de imágenes de calcio, se utilizan moléculas fluorescentes para monitorear la actividad de las células vivas en el sistema nervioso.
Direcciones futuras
Los científicos están trabajando para desarrollar proteínas fluorescentes más eficientes para mejorar el rendimiento de las sondas de imágenes. Se espera que la futura tecnología de imágenes de fluorescencia logre avances en múltiples dimensiones mediante métodos como la ingeniería genética y la estabilización ambiental.Las imágenes de fluorescencia ofrecen una amplia gama de oportunidades para explorar lo que sucede dentro de las células, así que ¿qué nuevos fenómenos biológicos podrían revelar los descubrimientos futuros?
